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1、1、基因工程又叫做 _ _ 或_。基因工程基因拼接技术DNA重组技术2、基本工具：“分子手术刀” “分子缝合针” 基因进入受体细胞的载体3、基本操作步骤：运载体运载体 DNADNA连接酶连接酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 1、目的基因的获取 2、基因表达载体的构建（核心） 3、将目的基因导入受体细胞 4、目的基因的检测与鉴定 黏性末端黏性末端限制性核酸内切酶一种限制性内切酶只能识别双链DNA分子的某种特 定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两 个核苷酸之间的磷酸二酯键断开（切割DNA分子）来源：主要从原核细胞分离 作用：作用结果：作用结果：EcoRI重难点剖析基因工程的“专用工具”平
2、未端（SmaI）及粘性未端（EcoRI ）1、种类：2、作用部位：Ecoli DNA连接酶（黏性末端）T4 DNA连接酶 （黏性末端和平末端）磷酸二酯键 DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起 来，即把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一个 重组的DNA分子就形成了。DNA连接酶“分子缝合针”分子运载车运载体（1） 作用：将目的基因送入受体细胞（2） 具备的条件： a.能自我复制.b.有切割位点. c.有标记基因. d.对受体细胞无害. 质粒、噬菌体、动植物病毒（3）种类：质粒细菌拟 核DNA外能自主 复制的很小的环 状DNA分子（一）目的基因的提取 目的基因：主要是指_ 。 获取方法：
3、1、_中获取目的基因 2、人工合成法：化学方法合成DNA片段（DNA合 成仪） 3、 PCR反应扩增DNA基本操作步骤从基因文库编码蛋白质的结构基因 原理：DNA复制 过程：加热DNA解链 冷却引物结合到互补DNA 链 互补链合成 条件 ：耐高温DNA聚合酶 基因文库的构建提取某种生物的全部DNA用适当的限制酶切一定大小的DNA片段将DNA片段与载体连接导入受体菌中储存基因组文库某种生物的mRNA单链互补DNA双链cDNA片段导入受体菌中储存与载体连接cDNA文库逆转录（二）基因表达载体构建1、基因表达载体由_、_ _、_四部分组成。目的基因启动子标记基因 终止子2、启动子作用：3、标记基因的
4、作用：RNA聚合酶识别和结合的位点 鉴别受体细胞中是否含有目的基因 筛选出含目的基因的细胞（1）用一定的_切割 质粒，使其出现一个切口，露 出_。（2）用_切断 目的基因，使其产生_。（3）将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再 加入适量_，形成了一个重组DNA分子 （重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶相同的黏性末端切口 DNA连接酶重组质粒形成过程:导入植物 细胞：（三）将目的基因导入受体细胞导入动物 细胞 ：导入微生物细胞 ：受体细胞 导入方法体细胞 受精卵受精卵 显微注射法Ca2处理法农杆菌转化法 基因枪法花粉管通道法将目的基因导入微生物细胞原核生物繁殖快、多为单细 胞、遗传物质相对较
5、少，故早 期常作为受体细胞。大肠杆菌细胞用Ca2+处理感受态细胞重组表达载体DNA溶于缓冲液混合转入目的基因是否插入转基 因生物染色体的DNA：（四）目的基因的检测与鉴定目的基因是否表达 ：目的基因是否转录 ：方法: DNA分子杂交方法: 分 子 杂 交方法: 抗原抗体杂交鉴定抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等检测转基因生物 转基因生物是指利用 技术导 入 培育出的能够将新性状稳定地给后代的 生物。基因工程 外源基因 遗传基因工程优点 ： 打破了常规育种难以突破的， 的 改变了生物的遗传性状物种之间的界限定向1、抗虫转基因植物（一）植物基因工程硕果累累2、抗病转基因生物 3、抗逆转基因作物基 因
6、工 程 的 应 用4、利用转基因改良植物的品质 方法：用转基因动物生产药物-动物乳腺生物反应器获取目的基因 （药用蛋白基因）构建基因表达载体 （在药用蛋白基因前加乳 腺蛋白基因的启动子）显微注射导入哺乳 动物受精卵中形成早期 胚胎将胚胎送入母体动物发育成转基因动物（只有在产下的雌性动物个体中，转入 的基因才能表达）（二）动物基因工程前景广阔 用转基因动物作器官移植的供体供体动物：存在的难题：解决方法：猪免疫排斥将供体基因组导入某种基因调节因子，以抑制抗原 决定基因的表达，或设法除去抗原决定基因，再结 合克隆技术，培育出没有免疫排斥反应的转基因克 隆猪器官。（三）、基因工程药品异军突起 工程菌：
7、用基因工程的方法，使外源基因得到高效率表达的菌类细 胞株系。我国已生产的产品：白细胞介素-2、干扰素、乙肝疫苗等（四）基因诊断与基因治疗 基因诊断：用放射性同位素 等标记的“DNA探针”检测肝炎 病毒等病毒感染及遗传缺陷， 不但准确而且迅速。我国研究人员正在制备 用于基因治疗的基因工 程细胞基因治疗：把健康的外源基因 导入有基因缺陷的细胞中，达到 治疗疾病的目的。体外基因治疗体内基因治疗基因治疗的形式比较：基因工程和蛋白质工程基因工程蛋白质工程相同点都要改造基因，都属于分子水平产生新的基因型，无新基因基因（型）产生的蛋白质原有的新的联系蛋白质工程以基因工程为基础， 是基因工程的应用和延伸蛋白质
8、工程流程图1.从预期的蛋白质功能出发2.设计预期的蛋白质结构3.推测应用的氨基酸序列4.找到相应的脱氧核苷酸序列板书：用干扰素例子，反推过程。 第4步后接着做什么？基因 DNA mRNA 氨基酸序列 多肽链 蛋白质 三维结构 转录 翻译 折叠 生物功能 预期功能 分子 设计 DNA合成 中心法则 蛋白质工程 细胞工程 1、概念:应用的原理和方法研究的水平研究的目的细胞生物学和分子生物学细胞整体水平或细胞器水平按照人们的意愿来改变细胞内 的遗传物质或获得细胞产品 2、分类植物细胞工程 动物细胞工程 微生物工程所采用技术 的理论基础 植 物 细 胞 工 程通常采用的 技术手段 植物组织培养 植物体
9、细胞杂交植物细胞的全能性植物细胞工程 (离体的植物 器官、组织或细胞)脱分化再分化 愈伤组织根、芽（胚状体）植物体培养条件：离体、含有全部营养成分的培养基、一定的 温度、空气、无菌环境、适合的PH、适合的 光照等外植体举例：花药离体培养 基因工程培育的抗棉铃虫的棉花植株 细胞工程中培育的“番茄-马铃薯”杂种植株1、植物组织培养 植物A细胞植物B细胞去壁原生质体A原生质体B原生质 体融合融合细胞再生壁杂种细胞脱分化去壁的常用方法：酶解法（纤维素酶、果胶酶等）原生质体融合方法：物理法：离心、振动、电刺激等 化学法：聚乙二醇（PEG） 融合成功的标志人工诱导筛选愈伤组织杂种植株再分化2、植物体细胞杂
10、交的过程（1）植物繁殖的新途径 1）微型繁殖（快速繁殖）2）作物脱毒3）神奇的人工种子（2）作物新品种的培育 1）单倍体育种 2）突变体的利用 3）转基因植物的培育 （3）细胞产物的工厂化生产3、植物细胞工程的实际应用动物细胞工程常用的技术手段：植物细胞工程常用的技术手段有哪些？植物组织培养、 植物体细胞杂交强调：是其他动物 细胞工程技术的基础。动物细胞培养 动物细胞核移植 动物细胞融合 单克隆抗体 动物细胞培养技术 动物胚胎或幼龄动物的 组织、器官胰蛋白酶剪碎单个细胞加培养液制成细胞悬 浮液去掉组织 间蛋白10代细 胞50代 细胞无限传代原代培养传代培养部分细胞遗传物质改变动物细胞培养不能最
11、终培养成动物体随细胞增多 ，细胞就会 停止分裂增 殖1 动物细胞培养 植物组织培养和动物细胞培养的比较项目培养基结果应用植物组织 培养动物细胞 培养均需适宜的外界条件：PH,温度,营养及“无菌,无毒环境”固体，营养物质， 蔗糖、植物激素培养成植株液体，营养物质， 葡萄糖、动物血清培育成细胞 系或细胞株（1）生产蛋白质制品 （如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体、动物激素） （2）用于某些器官移植（1）试管苗的快速繁殖 （2）无病毒植物的培育 （3）生产药物等 （4）人工种子 （5）转基因植物的培育细胞A细胞B杂种细胞物理法、 化学法灭活的仙台病毒2、动物细胞融合过程诱导动物细胞融合与植物原生质体融合
12、的原理和方法是否 基本相同？ 制备单克隆抗体不具有繁殖性 但具有抗原性主要用于制备单克 隆抗体获得杂种植株用途物理、化学方法（ 同左） 生物：灭活的病毒物理（离心、振荡 、电刺激）化学（PEG）诱导方法使细胞分散后诱导 细胞融合去除细胞壁后诱 导原生质体融合细胞融合的方法细胞膜的流动性细胞膜的流动性、 植物细胞全能性原理动物细胞融合植物体细胞杂交比较项目植物体细胞杂交、动物细胞融合的比较抗原 动物体内刺激 效应B 抗体 特点：产量低、特异性差、纯度低、反应不够灵敏五、单克隆抗体1、常规抗体制备：一个B淋巴细胞：只分泌一种特异性抗体2、单克隆抗体杂交瘤细胞 小鼠骨髓瘤细胞：能无限增殖融合 单克隆
13、抗体 培养 抗原注入小鼠体内已免疫的B淋巴细胞骨髓瘤细胞筛选出杂交瘤细胞筛选出能产生特异性抗体的细胞群体外培养体内培养从培养液中提取从小鼠腹水中提取单克隆抗体细胞融合动物细胞培养单克隆抗体的制备(特定的选择培养基) 主要用于疾病的诊断、治疗和预防。 若在单抗上带上抗癌药物制成“生物导弹”，将药物定向 带到癌细胞所在部位，既消灭了癌细胞又不会伤害健康细 胞。 特点：与常规抗体相比，具有特异性强、灵敏度高、化学 性质单一的优点。单克隆抗体的应用单克隆抗体是指： 杂交瘤细胞产生的单一抗体卵细胞母绵羊母绵羊乳腺细胞细胞质细胞核细胞核移植早期胚胎卵裂C母绵羊子宫胚胎移植多莉羊分娩 妊娠 多莉羊的培育过程
14、融合后的卵细胞核移植动物细胞核有 全能性例(06江苏)下图是单克隆抗体制备流程阶段示意图。（1）_技术是单克隆抗体技术的基础。 （2）根据培养基的用途分类，图中HAT培养基属于_培养基。 （3）单克隆抗体与常规的血清抗体相比，最大的优越性是_。 （4）动物细胞融合除了采用植物细胞原生质体融合常用的诱导剂外，还可以采 用_。 （5）选出的杂交瘤细胞既具备骨髓瘤细胞的_特点，又具备淋巴 细胞的_特点。 （6）淋巴细胞是由动物体_中的_细胞分化、发育而来。 （7）杂交瘤细胞从培养基中吸收葡萄糖、氨基酸的主要方式是_。动物细胞培养选择 特异性强,灵敏度高灭活的病毒 在体外大量增殖分泌特异性抗体 骨髓造血干细胞主动运输6、基因型为AaBb的水稻(具有24条染色体)的花粉通过无菌操作， 接入试管后，在一定条件下形成试管苗的育种过程。 (1)愈伤组织是花粉细胞不断分裂后的形成的不规则细胞团，愈伤组 织形成中，必须从培养基中获得_。(2)要促进花粉细胞分裂生长，培养基中应有_和_两 类激素。 (3)愈伤组织分化是指愈伤组织形成芽和根，再由芽发育成叶和茎。 这一过程必须给予光照，其原因是_利用光照制造有 机物，供试管苗生长。 (4)试管苗的细胞核中含有_条脱氧核苷酸链。 (5)培养出的试管基因型有 。如果要获得育种需 要的植株，并能繁殖新品种，后
