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1、植物黄酮次生代谢中植物黄酮次生代谢中 CHSCHS、CHICHI 基因的相关研究基因的相关研究摘要：摘要：黄酮类化合物是一类植物的次生代谢产物，有抗炎、抗病毒、利胆、强心、镇静和镇痛等作用外，还具有抗氧化、抗衰老、免疫调节和抗肿瘤等效果，因此，黄酮类化合物在医药、食品、保健品等方面的应用十分广泛。在生物合成黄酮途径中，查尔酮合成酶和查尔酮异构酶是关键酶和限速酶。本文介绍了生物合成黄酮类化合物途径中的 CHS、CHI 两个基因及其作用机制，简述了研究人员从第一次研究CHS、CHI 基因到现今以来对这两个酶的研究进展，通过总结得出，CHS 的开放阅读框在 1.2kb 左右，大约编码 399 个氨基
2、酸，CHI 基因家族的开放阅读框长为 600-15000bp，编码 200-400 个碱基，两个基因的保守性都比较强。此外，目前的研究还不能完全揭示各种因子对黄酮类化合物代谢关键酶的转录、表达及活性的影响，还需要在这方面作进一步的研究。关键词：关键词：黄酮类化合物；CHS；CHIThe research of the CHS and CHI genes in Plant secondary metabolism of flavonoids YANG Huo-LiCollege of life and environment science，Minzu University of ChinaBe
3、iJing 10081Abstract: lavones compounds are a class of important secondary metabolites in plants，Having the effect of anti-inflammatory, antiviral, cholagogue function, cardiac, sedation and analgesia, also having theeffect of anti-oxidation, anti-aging, immunomodulatory and antitumor .it is really p
4、opularMedicine, food, health care productsIn the biosynthesis of flavonoids way，Synthetase and chalcone isom erase chalcone is the key enzyme and speed limiting enzymeThis article describes the mechanism of CHS the biosynthesis of flavonoids way Keywords: Flavones compounds ； CHS ； CHI前言黄酮类化合物是一类在高等
5、植物中大量存在的重要次生代谢产物,是植物在长期的生态适应过程中为抵御恶劣生态条件、动物和微生物等攻击具而形成的。黄酮类化合物有很多重要的功能,如参与花色的形成、UV 防护、抵抗病原体等。目前研究表明,它们还与人类的健康有着密切的关系,具有消除氧自由基、抗炎、抗癌、保护心脑血管系统等多种药理作用1。在生物合成黄酮类化合的路径中，查尔酮合酶(CHS)和查尔酮异构酶（CHI)是其中的关键酶和限速酶。目前，对这两种酶基因的研究已成为植物次生代谢黄酮类化合物合成路径研究的重点之一，各专家学者对不同植物中的 CHS、CHI 基因的研究已较为深入。如已克隆出拟南芥 、白菜 、水 稻 、玉 米 、大豆 、高粱
6、 、康乃馨、西洋梨、番茄和葡萄等植物的 CHS 基因2-7。目前，通过对 GenBank 已登录的这 10 种植物中 CHS 基因的研究发现，CHS 开放阅读框的全长在 1.2 kb 左右，大约编码 399 个氨基酸8。自 1987 年 CHI基因首先从法国豌豆中利用抗体技术分离出来以来，CHI 基因已陆续从矮牵牛、菜豆、玉米、豌豆、紫花苜蓿、翠菊、橙、水母雪莲等多种植物中克隆出来9-10。本文将针对植物中的 CHS、CHI 基因研究作一个概述。1.查尔酮合成酶基因（CHS）1.1CHS 的功能和作用机制查尔酮合成酶介导了黄酮类化合物合成的第一步，催化三个三分子丙二酸单酰-CoA，与一个分子的
7、香豆酰辅酶 A 缩合成柚皮素查尔酮，在经由 CHI 的异构作用衍生出其他黄酮类化合物11。查尔酮合酶的底物大多来源于苯丙氨酸途径的 4-香豆素辅酶 A，而在少数一些植物中，查尔酮合酶的底物可以是肉桂酰辅酶 A 或咖啡酰辅酶 A12。查尔酮合酶基因在不同植物类群中保守性较高，基因含有 2 个外显子和 1 个内含子。内含子的大小及序中的位置比较保守，不同物种中的氨基酸水平的一致性很高，约为 79%-91%。CHS 基因的启动子具有多个特异的元件，如与接收激发因子诱导所必须的 ACE 元件，以及负调控的沉默子、维持基因转录水平的 P 区13 。1.2 CHS 基因的研究进展对 CHS 基因的研究最早
8、的是矮牵牛中的 CHS 基因家族，获得 8 个 CHS 基因全长序列和 4 条 CHS 基因片段序列，组成一个多基因家族1。从此之后，研究人员对各种植物中CHS 基因的研究更加深入。杨丽，刘雅莉等14根据报道的查尔酮合成酶基因的保守序列，设计了特异简并引物，以东方百合 Sorbonne 盛开的花瓣总 RNA 为模板，逆转录合成 cDNA 第一链，用特异引物对此双链 cDNA 进行 PCR 扩增，将扩增后的基因片段回收克隆后，测序得到目的序列长873bp，与已发表的百合中 CHS 基因的同源性达 91%，说明克隆的片段属于查尔酮合成酶基因，GenBank 上的登录号为 DQ471950。周琳等1
9、5以牡丹品种“彩绘”为试材，采用 RT-PCR 和 RACE 方法从花瓣中获得了一个牡丹查尔酮合成酶基因 cDNA 全长，命名为 Ps-CHS1,GenBank 登录号为 GQ483511.序列分析结果表明，Ps-CHS1 全长 1457pb,包含 82bp 的 5非编码区、208pb 的 3非编码区和一个长度为 1185bp 编码 394 个氨基酸的开放阅读框。氨基酸序列分析显示该基因编码的蛋白具有 CHS 家族保守存在的所有功能活性位点和特征多肽序列。序列比对和系统进化分析表明，Ps-CHS1 与杨柳科、锦葵科、蔷薇科等植物的 CHS 亲缘关系较近，相似度达 90%以上。杨俊波等16用 P
10、CR 方法从石笔木中的总 DNA 中扩增 CHS 基因外显子 2 的部分序列，得到 12 个序列，经排序和系统树的构建分析，所有被测定的序列同源性均高于 70，为CHS 基因家族的成员。研究者预测，山茶科 CHS 基因家族较大，且有着复杂的进化式样。PaIlg 等17克隆得到了银杏 CHS 的基因 G6C 月 S(GenBank 登陆-号 AY647263)，该序列全长 1295bp表达产物的相对分子质量为 42 kDa, Southern blot 显示其属于多基因家族，并且在根、茎、叶等不同部位的表达情况不同。2.查尔酮异构酶基2.1CHI 功能和作用机制在异黄酮合成途径中，查尔酮合成酶(
11、CHS)催化合成反应的第一步，查尔酮异构酶(CHI)催化第二步反应，由一个香豆酰-CoA 和三个丙二酸单酰-CoA 在 CHS 的作用下生成查尔酮。查尔酮再经过 CHI 的作用形成二氢黄酮，二氢黄酮再在各种酶的催化下转化为其它各种颜色类型的黄烷酮化合物18。查尔酮异构酶也是植物抗毒素生物合成所必需的酶，分子量因植物的种类而异19，约 24103-29103，其多肽链在不同物种间表现出高度的同源性。不同植物查尔酮异构酶的同源性为 4982，不同类型间查尔酮异构酶的同源性仅有 50左右，但同一类型查尔酮异构酶的同源性可达 70以上20。查尔酮异构酶催化分子内的环化反应，其底物为查尔酮合酶催化合成的
12、查尔酮(4，2，4，6一四羟基查尔酮)或6-脱氧查尔酮(4,2，4,6-四羟查尔酮)。查尔酮异构酶的催化活性具有立体异构性，它的催化效率随着反应体系中 pH 的不同而不同。当 pH 为 75 时，催化活性为 90；在 pH为 6.0 时，催化活性只有 50。按 CHI 作用底物的不同，可将 CHI 基因分为 2 类。TypeI的 CHl 只能以 6-羟基查尔酮(6-hydroxychalcone)底物，如黄瓜中存在的 CHI。TypeII 的 CHI一般存在于豆科植物中。TypeII 的 CHI 既可以 6-羟基查尔酮底物，也可以 6-脱氧查尔酮(6-deoxychalcone)为底物。Gen
13、sheimer 等21的研究结果表明，可以把真菌和细菌中的 3 类 CHI蛋白基因家族归为 TypeI。CHI 基因为多基因家族。矮牵牛中含有 2 个 CHI 基因，同属于Type 。豆科植物百脉根中含有 3 种 CHI 基因，其中 CHI2 属于 Type I，CHI1 和 CHI3 则同属 TypeII。查尔酮异构酶的整体空间结构像是由开面的 D 一三明治折叠形成的倒置花束。这种特殊结构在植物中具有唯一性，已被建议作为一种植物特有的基因及结构标记。2.2CHI 研究进展查尔酮异构酶是类黄酮合成途径中早期阶段的关键酶之一，是植物花色素苷生物合成和豆科异黄酮植物植保素合成所必需的酶，它以单体的
14、形式普遍存在于大多数植物中，其蛋白的三维折叠结构在植物中具有唯一性，已被看成是一种植物特有的基因标记 l。因此，基因调控机制的研究对于了解豆科植物异黄酮生物合成特性和花色形成的分子机制有重要的意义。1987 年，Mehdy 等22利用抗体技术首次从法国豌豆中分离出 C 胁基因，1988 年 van Tunen AJ23从矮牵牛中克隆了两个 CHI 基因：CHIA 与 CHIB 基因。CHIA 基因全长726bp，编码 241 个氨基酸；CHIB 基因全长 2170bp，编码 220 个氨基酸。在植物的不同组织中，这两个基因的表达具有特异性，通常在成熟的花冠和雄蕊中表达 CHIA，在未成熟的花药
15、中表达 CHIB。1994 年，Wood AJ 等24从豌豆上胚轴中克隆得到 CHI 基因，基因全长 986 bp，编码 233 个氨基酸，其氨基酸组成与矮牵牛和菜豆的氨基酸序列具有较高的同源性。2006 年，Li 等25从水母雪莲 eDNA 文库中分离得到 CHI 基因与其 CHI 基因组序列相同，都为 699bp，没有内含子的存在。迄今在细菌中也分离到类 CHI 蛋白，如在人类粪便的厌氧真细菌中也纯化至 UCHI 蛋白，这种蛋白具有异构化柚皮素、紫铆因、异甘草素的活性，能将这些物质异构化，然后还原、脱水，最后降解成间苯三酚和 3-(4-羟基)-丙氨酸。李军等26采用逆转录一聚合酶链式反应(
16、RTPcR)以及温度非对称交互 PCR(TAIL-PCR)方法，从大花美人蕉花瓣组织中扩增查尔酮异构酶基因(CHI)的全长 eDNA(678 bp)，编码 226 个氨基酸，其氨基酸组成与其它已知的高等植物 CHI 基因具有很高的同源性，与葡萄、草莓、丁香、柑桔矮牵牛、洋葱及玉米的同源性分别为82、79、80、80、79、8l和 76。马春雷等27采用 EST 测序技术和 T4 砌叮 A 连接酶介导的 5RACE 技术，获得了一个茶树儿茶素代谢中的重要基因一查尔酮异构酶(CHI)基因，在 GenBank 登录(DQ904329)，其序列全长 1163bp，其中开放阅读框长 723 bp，编码 240 个氨基酸，3端有一个明显的多聚腺苷酸加尾信号，推测的蛋白分子量约为 2
