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1、治疗性血管新生实验研 究的若干进展金 惠 铭复旦大学上海医学院生理与病理生理学系 上海 200032，中国治疗性血管新生实验研究 的若干进展治疗性血管新生的概念及现况一.血管新生旁观分子对内皮细胞增殖的影响二.生长因子对内皮细胞迁移的双相调节三. 内皮细胞生长因子受体活性的动态变化四. 血管内皮祖细胞治疗性血管新生的概念及现况TherapeuticAngiogenesis治疗性血管新生将外源性血管新生诱导因子导入缺血组织，增强缺血区毛细血管新生，从而加速侧枝循环的形成。主要用于治疗缺血性(心血管)疾病。Folkman, J肌肉注射局部灌注 A.V.滴注渗透泵心腔外注入病毒载体介导 局部注射基因
2、埋线基因治疗 脂质介导 球囊导管导入转化细胞包被应用质粒DNA介导 冠脉内支架蛋白治疗VEGF治疗细胞治疗治疗性血管新生常用的方法细胞铺路 Cellular Spreading分子搭桥 Molecular BridgingFolkman JFrom the lab to the clinic: one investigators journeyJ Law, Medicine & Ethics 2002, 30(3): 361366从实验室到临床:一位科学家的旅行 一.血管新生旁观分子对 内皮细胞增殖的影响Bystander molecules(血管新生) 旁观分子COX-2，PGE2，Inte
3、grins，etc.bEnd.3 (200 )经典途径bFGF-induced proliferation of bEnd.3 (MTT)-actinEffect of bFGF on COX-2 protein expression in bEnd.3 (Western Blot)COX-20 4 8 16 32Time(h)0 0.5 2.5 5 10 15bFGF(ng/ml)Control bFGFEffect of bFGF(10ng/ml) on COX2 protein expression in bEnd.3 (8h,ABCmethod,400X)GAPDHCOX-1COX-2
4、 0 1 2 3 6 12Time(h)0 0.5 2.5 5 10 15bFGF(ng/ml)Effect of bFGF on COX mRNA expression in bEnd.3 (RT-PCR)bFGF-induced PGE2 secretion of bEnd.3 & effect of COX-2 inhibitor on it (ELISA)Effects of COX-2 inhibitor and PGEEffects of COX-2 inhibitor and PGE2 2R R antagonist on antagonist on bFGFbFGF-induc
5、ed VEGF -induced VEGF secretion in bEnd.3secretion in bEnd.3bFGFEC增殖VEGFCOX-2PGE2bFGF引起EC多途径增殖经典途径旁路 途 径信号转换信号转换bFGFbFGF非特异性非特异性 ECEC特异性特异性VEGFVEGF二.生长因子对内皮细胞迁 移的双相调节EC划痕损伤模型 EC scratch wound model 研究: 细胞迁移 ( cell migration)Dynamic changes of cell migration induced bybFGF in cultured bEnd.3 Left: bF
6、GF (5g/L) Center: control Right: bFGF (15 g/L)0h24h48h内皮细胞体外划痕损伤模型中bFGF对 细胞迁移的影响Focal Adhesion Kinase粘着斑激酶FAKNBand 4.1Kinase DomainFGFCPhosphorylation FAK Tyr-397F.A.TY397Activitied FAKPGrowth Factor Receptor PTKsPro-1Pro-2FAKRasRafMEKERKCrkSOSSrcPaxillinCASGrb2PWAVE/ScarDOCK180RacPakASAGRAFMigratio
7、nGTPaseFAK含量051015(g/L)bFGF对血管内皮细胞中FAK含量的影响 (Western Blot, 12h)bFGF*P0.05*FAK活性 051015(g/ml)bFGF对血管内皮细胞中FAK活性的影响 (12h)* P0.050h6h12h510bp(FAK)510bp(FAK)510bp(FAK)450bp(GAPDH )450bp(GAPDH )450bp(GAPDH)1. og./L bFGF 2. 5g/L 3. 10g/L 4. 15g/L2. bFGF对FAK mRNA表达的影响 (RT-PCR)内皮细胞生长因子受体活性的动态变化三.VEGF受体(Flk-1
8、)在心肌梗死大鼠心肌微血管内皮细 胞上的表达 (免疫组化，ABC法 400)A. 梗死区 B. 梗死边缘 C. 非梗死区 D. 对照心肌ABCDExpression changes of bFGFR1 after rat acute myocardialinfarction (Real-time RT-PCR, n=5)*#*# *#*#*#*#*/GEArrayTM Q series Mouse Angiogenesis Gene Array小鼠血管新生基因芯片(Super Array, U.S.A.)非梗死区边缘区心肌梗死大鼠心肌细胞内血管新生 基因表达的变化 (Micro-array)心
9、肌梗死大鼠心肌微血管内皮细细胞血管新生诱诱 导导因子受体基因表达的变变化 (1W)PositionGenebankGene nameControlExperiment14NM_010109Ephrin A receptor1.474E-12.170E-2 17NM_007912EGFR-0.000E-1-0.000E-1 29M33760FGFR10.004E-12.773E-4 30M81342FGFR38.731E-39.014E-4 31NM_008011FGFR42.816E+03.077E+0 33X59397Flk-1/KDR1.199E+01.049E+0 34L07297Flt
10、-1-0.000E-12.773E-3 59NM_011058pDGFR-0.000E-12.982E-360NM_008809pDGFR-0.000E-15.055E-2 76D13738Tie-2-0.000E-19.014E-4 81D28526TGFR1-0.000E-10.000E+0 82NM_009371TGFR22.834E-11.907E-2四.血管内皮祖细胞 (Endothelial Progenitor Cell)磁性活化细胞分选系统 Magnetic activated Cell -sorting system (MACS)MicroBeads: 50nm 用MACS
11、分离脐血中CD133+ 细胞模式图经磁珠分离的CD133+细胞培养14d后细胞表面分子标 志CD133流式细胞仪鉴定结果 (A:0d B:14d)ABDecrease of cell markers CD133, CD34 on adherent cells and increase of Flk-1 in the presence of VEGF, bFGF and SCF after 14 days of culture (P0.05).干细胞血管内皮祖细胞造血干细胞内皮祖细胞，内皮细胞，造血干细胞循环CD34+内皮祖细胞，内皮细胞CD34+, Flk-1+内皮祖细胞CD34+, Flk-
12、1+,AC133 +培养内皮细胞CD34+, Flk-1+,AC133本课题受国家“十五”“211”工程重点学科建设基金资 助参加本课题的研究人员乐 飞 张国平 王新红 梁光波 张 威 史连国 曲晓义 钱睿哲Angiogenesis inducible factors: VEGF etc. To stimulate proliferation of EC Angiogenesis inhibited factors:Angiostatin etc. To inhibit proliferation of ECAsian Microcirculation award 血管新生诱导因子血管内皮细胞 增殖、迁移、 管腔形成新生血管形成血管基底膜降 解、血管外基 质重塑血管新生的过程
