细胞生物反应器制药

《细胞生物反应器制药》由会员分享，可在线阅读，更多相关《细胞生物反应器制药（44页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、第三章第三章 细胞工程制药细胞工程制药转基因动物与生物反应器转基因动物与生物反应器2第一节第一节 转基因动物转基因动物转基因动物是指通过实验方法，人工地把人们想 要研究的动物或人类基因，或者是有经济价值的 药物蛋白质基因等，通常称为外源基因，导入动 物的受精卵（或早期胚胎细胞），使之与动物本 身的基因组整合在一起，这样外源基因能随细胞 的分裂而增殖，并能稳定地遗传给下一代的一类动物。外源目的基因的制备外源目的基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞选择获得携有目的基因的细胞选择合适的体外培养系统和宿主动物转基因细胞胚胎发育及鉴定筛选所得的转基因动物品系以绿色荧光蛋白转基因小鼠为例：Gene const

2、ruct pEGFP- N1 载体是一种把异源性的蛋白质融合至EGFP 的N端的哺乳动物表达载体，含有人类巨细胞病毒（CMV）启动子，SV40 Poly A 尾，pUC 复制起始点（原核）和SV40 复制起始点（真核），20 个多克隆位点，具有筛选标志卡那霉素（原核）和新霉素（真核）的抗性基因。异源性蛋白与EGFP 阅读框一致地克隆入pEGFP-N1，形成的表达重组体在CMV 启动子启动下，表达EGFP 和目标蛋白的融合蛋白。波长490 nm的紫外线激发后，可在荧光显微镜下,观察到绿色荧光，在多种异源生物中表达且无细胞毒性。microinjection受精卵准备胚胎操作过程 显微注射假孕母鼠准

3、备(养母)胚胎移植Transgene analysisTransgene analysisBiopsyPCR analysisSouthern blotPhenotypic analysis Phenotypic analysisPhenotypic Analysis on founders harboring GFP genePhenotypic Analysis on founders harboring GFP gene(9.5 dpc) GFP+, GFP- embryos GFP+ tail GFP-, GFP+ miceGurdon et al, Nature, 1971, (Gu

4、rdon et al, Nature, 1971, (蛙卵和小鼠胚胎注射蛙卵和小鼠胚胎注射 mRNA)mRNA)-显微注射技术的尝试显微注射技术的尝试JaenischJaenisch，PNAS, 1974, 1976PNAS, 1974, 1976，逆转录病毒感染小鼠，逆转录病毒感染小鼠 的的囊胚囊胚，使病毒，使病毒DNADNA整合到小鼠的基因组中，并传递给整合到小鼠的基因组中，并传递给 后代后代-不能广泛应用，只是少数不能广泛应用，只是少数ESES细胞整合外源基因，细胞整合外源基因， 部分组织有外源基因部分组织有外源基因 Gordon et al, PNAS, 1980; Brinster

5、et al, Cell, Gordon et al, PNAS, 1980; Brinster et al, Cell, 1981; Costantini Wagner 1981; Costantini Wagner et al, PNAS, 1981et al, PNAS, 1981-显微注射技术建立，基因结构没显微注射技术建立，基因结构没有合理和认真的设计，不能分析基因的生理功能有合理和认真的设计，不能分析基因的生理功能第一阶段：方法的建立Palmiter, Brinster, Hammer et al, 1982, Palmiter, Brinster, Hammer et al, 19

6、82, NatureNature(MT-GH)-(MT-GH)-超级小鼠超级小鼠 其它功能基因其它功能基因-基础研究中一直使用基础研究中一直使用 Hammer et al, 1985, Hammer et al, 1985, NatureNature (rabbit, sheep, (rabbit, sheep, pig)pig) GHGH为主，开始关注转基因动物的病理变化为主，开始关注转基因动物的病理变化第二阶段：转基因小鼠模型及快速生长家畜TM transgene miceTM transgene miceDenning et al 2001, Denning et al 2001,Nat

7、 Biotech. Nat Biotech.(GT & PrP)(GT & PrP)Dai et al, 2002, Dai et al, 2002, Nat Biotech Nat Biotech (GT-out pig) (GT-out pig)Lai et al, 2002, Lai et al, 2002, Science (GT-out pig) Science (GT-out pig) GT:GT:半乳糖转移酶第三阶段：异种器官移植 (pig)和乳腺反应器外源基因导入动物细胞的方法：外源基因导入动物细胞的方法：转基因动物的制备：转基因动物的制备：核心技是如何把目的基因转核心技是如何

8、把目的基因转入动物早期胚胎细胞中入动物早期胚胎细胞中1.1.原核期胚胎显微注射法原核期胚胎显微注射法2.2.反转录病毒感染法反转录病毒感染法3.3.胚胎干细胞法胚胎干细胞法4.4.精子载体法精子载体法5.5.人工酵母染色体法人工酵母染色体法6.6.受精前卵细胞显微注射法受精前卵细胞显微注射法原核期胚胎显微注射：原核期胚胎显微注射： 创始人创始人JaenishJaenish（1974), 1974), 主要步骤：公母畜主要步骤：公母畜交配（或通过人工授精）获交配（或通过人工授精）获得原核期受精卵，外源裸露得原核期受精卵，外源裸露DNADNA通过徽注射导入受精卵通过徽注射导入受精卵，然后将徽注射后

9、的受精卵，然后将徽注射后的受精卵移入受体输卵管中继续发育移入受体输卵管中继续发育。通过激素疗法使小鼠超数排卵，开始时注射雌性妊娠血清，通过激素疗法使小鼠超数排卵，开始时注射雌性妊娠血清，4848小时后再注射人绒毛膜促进腺激素，这时小鼠便会超数排小时后再注射人绒毛膜促进腺激素，这时小鼠便会超数排卵，一般情况下卵，一般情况下5-105-10个，超个，超 数排卵为数排卵为3535个；个；与雄性小鼠交配，然后杀掉小鼠，从其输卵管内取出受精卵与雄性小鼠交配，然后杀掉小鼠，从其输卵管内取出受精卵将经纯化的转基因样品迅速注射入受精卵中变大雄性原核内将经纯化的转基因样品迅速注射入受精卵中变大雄性原核内将将25

10、-4025-40个注射了转基因的受精卵移植入代孕小鼠体内个注射了转基因的受精卵移植入代孕小鼠体内 ；受精卵发育成胚胎，并繁殖成转基因小鼠子代受精卵发育成胚胎，并繁殖成转基因小鼠子代 ；从小鼠子代体内取出从小鼠子代体内取出DNADNA样品，进行杂交，鉴定转基因的整样品，进行杂交，鉴定转基因的整合与否及位点合与否及位点 ；子代小鼠间进行再交配，繁殖，观察转基因是否遗传及表达子代小鼠间进行再交配，繁殖，观察转基因是否遗传及表达*细胞工程13*细胞工程141.可靠性高、重复性好 2.对于小鼠来说，产生转基因动物的效率比较高 3.导入DNA片段的大小和类型不受限制 4.转基因在代与代之间传递的稳定性好

11、5.整合位点的随意性可能对转基因表达造成影响 6.可能会出现不希望的插入突变 7.开发装置和技术的花费大时间长*细胞工程15显微注射法获得转基因鼠的成活率*细胞工程16利用脉冲电场提高细胞膜的通透性，从而使外源DNA转移至细胞中。此法简单、效率较高，广泛应用于培养细胞的基因转移。电穿孔法实现外源基因的转移反转录病毒感染法：反转录病毒感染法：利用反转录病毒利用反转录病毒LTRsLTRs（长末端重复序列）区域具（长末端重复序列）区域具有转录启动子活性特点，将有转录启动子活性特点，将外源基因连接到外源基因连接到LTRLTR下部进下部进行重组，再包装成为高滴度行重组，再包装成为高滴度病毒颗粒，去直接感

12、染受精病毒颗粒，去直接感染受精卵或徽注入囊胚腔中，携带卵或徽注入囊胚腔中，携带外源基因的反转录病毒外源基因的反转录病毒DNADNA可以整合到宿主染色体上。可以整合到宿主染色体上。转录启动子*细胞工程18缺点：1.低拷贝数2.需要逆转录病毒3.插入DNA大小有限4.可能产生不希望的重组5.高频的镶嵌现象6.逆转录病毒的序列可能干扰转基因表达胚胎干细胞介导法：胚胎干细胞介导法：将目的基因转移入将目的基因转移入ESES，重新导入，重新导入囊胚或经筛选后对转入外源基因囊胚或经筛选后对转入外源基因ESES进行克隆，可培育转基因个体进行克隆，可培育转基因个体。在小鼠上应用成熟，大动物较。在小鼠上应用成熟，

13、大动物较晚。从猪胚胎中获得了干细胞克晚。从猪胚胎中获得了干细胞克隆系隆系19881988，牛的胚胎干细胞，牛的胚胎干细胞19901990。建立大家畜。建立大家畜ESES细胞系仍很困难细胞系仍很困难，但随着一些相关关键技术的成，但随着一些相关关键技术的成熟，熟，ESES细胞介导法将会在转基因细胞介导法将会在转基因动物的研究中起到更加重要的作动物的研究中起到更加重要的作用用精子载体法精子载体法直接用精子作为外源直接用精子作为外源DNADNA载体的基因转移方法。载体的基因转移方法。 精子直接与外源精子直接与外源DNADNA混合培养，外源基因可以进入精混合培养，外源基因可以进入精 子头部，受精后能发育

14、成转基因动物，其整合率低子头部，受精后能发育成转基因动物，其整合率低 （鸡为（鸡为6.0%6.0%），但表达率高达），但表达率高达50%50%。许多因素影响许多因素影响DNADNA与精子结合。较长的与精子结合。较长的DNADNA片段片段 比较短的比较短的DNADNA片段（片段（150150750dp750dp）更容易被精子所摄）更容易被精子所摄 取。对精子和附睾精子的清洗可提高精子与取。对精子和附睾精子的清洗可提高精子与DNADNA的结的结 合率。目前已采用阳离子脂质体介导法，脂质体借合率。目前已采用阳离子脂质体介导法，脂质体借 静电作用吸附于细胞表面，通过与细胞膜融合，细静电作用吸附于细胞表

15、面，通过与细胞膜融合，细 胞内吞而将结合的基因导入细胞。胞内吞而将结合的基因导入细胞。受精前卵细胞显微注射法受精前卵细胞显微注射法AnthonyAnthony等（等（19991999）尝试一种新方法：预先将小）尝试一种新方法：预先将小 鼠精子进行破膜处理，与编码绿色荧光蛋白鼠精子进行破膜处理，与编码绿色荧光蛋白GFPGFP报告报告 分子的外源分子的外源DNADNA短时间（短时间（1min1min）共孵育，然后徽注射）共孵育，然后徽注射 入减数分裂入减数分裂IIII期的卵母细胞质中，取得期的卵母细胞质中，取得64%64%94%94%转转 基因表达胚胎。将转基因表达胚胎。将转GFPGFP的胚胎移植

16、，的胚胎移植，20%20%的后代表的后代表 现为基因整合。现为基因整合。此项研究揭示，精子膜经冷冻干燥或解冻处理后此项研究揭示，精子膜经冷冻干燥或解冻处理后 ，外源，外源DNADNA可穿过外膜，吸附于内膜。因此外源可穿过外膜，吸附于内膜。因此外源DNADNA 能通过精子的徽注射有效转入卵母细胞，经膜处理能通过精子的徽注射有效转入卵母细胞，经膜处理 的携外源的携外源DNADNA精子的徽注射是一种有效的转基因手段精子的徽注射是一种有效的转基因手段 。*细胞工程22四种方法比较四种方法比较方法方法显微注射显微注射胚胎干细胞胚胎干细胞逆转录病毒逆转录病毒精子介导精子介导优点优点外源基因整合效率外源基因整合效率较高，不需要载体较高，不需要载体，目的基因的长度，目的基因的长度可达可达100Kb100Kb外源外源DNADNA