《中医课题标书》由会员分享，可在线阅读，更多相关《中医课题标书（17页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、附件 2省中医药科技计划项目申请书2008yA006项目名称：温补肾阳法对哮喘小鼠骨髓 CD34+祖细胞分化的干预研究（此页不可另行附页） 三、项目研究前景分析三、项目研究前景分析（包括国内外同类项目研究现状，市场需求情况，研究开发意义， 可附主要参考文献）支气管哮喘(哮喘)是一种以嗜酸粒细胞 (Eos)浸润为主的气道反应性炎症和以气道高 反应性 (airway high reaction，AHR)为特征的疾病。当今世界上约有1.6亿哮喘病患者， 发病率呈逐年增长趋势。但其发病机制尚未完全明确。目前认为，气道炎症是哮喘AHR的基 础，而Eos是其关键的效应细胞。Eos被激活后，能释放EOS阳离
2、子蛋白(ECP)、主要碱基蛋 白(MBP)、血小板活化因子(PAF)和白三烯(LT)等，还能促使肥大细胞释放组胺、5-羟色 胺、LT及趋化因子，并建立“自身维持环” (serf-sustaining cycte)吸引更多EOS聚集到 炎症反应部位气道，从而形成一种周而复始的持续性(慢性)炎症反应，再释放 ECP、MBP、PAF和缓激肽，这些细胞因子分布到气道，对气道黏膜上皮细胞产生毒性破坏作 用，上皮成簇地脱落，将上皮细胞下的感觉神经末梢C纤维暴露，从而形成气道反应性增高。 近年来着眼于嗜酸粒细胞在哮喘气道中的浸润和凋亡的研究较多，但关于哮喘骨髓嗜酸粒 细胞分化的研究较少。 Eos 来源于骨髓
3、 CD34+祖细胞。一般情况下，Eos 祖细胞(Eos/B 祖细胞)在骨髓分化成熟 为 Eos，后者在骨髓中存储数日后被释放至血循环，并在 1h 内进入组织1。哮喘患者体内 诱导 CD34+细胞分化为 Eos 的刺激物增多，结果导致 Eos 从骨髓中释放增多，随后其在粘附 分子等因子的作用下移出循环系统，并在其特异性的趋化物如 Eotaxin 等作用下向肺组织 局部浸润。 IL-3、IL-5、IFN-等均可影响骨髓嗜酸粒细胞的分化、增殖及迁移。研究表明，变 应原吸入后5小时IL-3应答的嗜酸粒细胞祖细胞显著增加，变应原吸入后1224小时IL-5应 答的嗜酸粒细胞祖细胞显著增加，变应原吸入后48
4、小时，骨髓IFN-水平也显著增加，说 明变应原吸入后骨髓多种细胞因子水平以时间依赖的变化方式调节和控制着骨髓嗜酸粒细 胞祖细胞的分化、增殖及迁移活动2。其中IL-5是关键的嗜酸粒细胞生成因子。IL-5能特 异作用于嗜酸粒细胞，不仅可远距离地作用于骨髓嗜酸粒细胞祖细胞促进其繁殖、分化， 维持并延长成熟嗜酸粒细胞的生存期，引起嗜酸粒细胞趋化和黏附3。GM-CSF是刺激骨髓 嗜酸粒细胞分化、增殖和抗嗜酸粒细胞凋亡的细胞因子4。此外，嗜酸细胞活化趋化因子 Eotaxin也可在不依赖IL-3、IL-5、GM-CSF的情况下诱导嗜酸粒细胞从脐带血CD34+祖细胞的 分化5。信号转导子和转录激活子-5（ST
5、AT-5）也具有明显的促CD34+嗜酸粒细胞分化、增 殖作用6。现代研究发现哮喘动物骨髓CD34+祖细胞表明IL-5R及Eotaxin受体CCR3表达升 高。 现代医学研究表明：糖皮质激素泼尼松、强的松可抑制哮喘小鼠骨髓内CD34+造血细胞 的增殖分化及迁移至外周血。但哮喘治疗需坚持长期应用激素，对人体副作用大。目前， 西医尚无另外成药抑制哮喘骨髓Eos分化。因此，寻找一种代替激素能够降低哮喘骨髓Eos 生成并且毒副作用少的药物，具有巨大的市场潜力。 而祖国医学治疗哮喘有上千年的历史，积累了丰富的临床经验，其中温补肾阳法是治 疗缓解期哮喘的经典治法之一，疗效确切，毒副作用少。 现代医家对肾阳虚
6、在哮喘发病中的作用也有深刻认识。柯新桥7认为无论何时期，肾 虚(尤其是肾阳虚)是本病最根本的病理机制，并提出防治哮喘发作当以补肾温阳纳气为要。 沈自尹8在用以温补肾阳药为主的温阳片治疗哮喘的基础上，发现肾虚为哮喘患者的基本 体质。倪伟等9通过对缓解期哮喘患者肾阳虚与气道炎症的研究表明肾阳虚是哮喘缓解期 的主要病机。 实验研究也表明，温补肾阳法能对抗哮喘气道炎症，改善气道痉挛，调节有下丘脑-垂 体-肾上腺（HPA）轴等作用。如：张炜等10研究发现喘可治(巴戟天、仙灵脾等)可降低患 者Eos绝对计数、IgE水平，消除气道炎症。张惠勇等11通过实验发现喘可治(巴戟天、仙灵 脾等)雾化吸人能通过影响I
7、FN-和IL-4的含量来调节Th1Th2细胞比例，纠正免疫失衡， 抑制气道炎症。许建华等12研究发现补肾阳(鹿角片、肉苁蓉、巴戟天、鹅管石、熟附片、 肉桂)可使哮喘大鼠2受体mRNA明显上升。还发现13补肾定喘汤（鹿角片、肉苁蓉、巴戟 天、鹅管石、熟地、山药、山萸肉、茯苓、丹皮、泽泻、熟附片、肉桂)能使肺组织过高的 GR水平下降，可升高血浆促肾上腺皮质激素(ACTH)、皮质醇（CORT)水平，兴奋垂体一肾上 腺皮质系统。 温补肾阳法能使哮喘患者外周血或肺泡灌洗液中Eos数目降低，但其降低Eos的机制尚 未见有深入研究报道。Eos的产生，受骨髓微环境中的细胞、调节因子和细胞外基质调节。 中医理论
8、认为肾主骨生髓，故应用相关中药调控骨髓造血微环境，可能有减少哮喘时Eos生 成的作用。本研究选用临床应用颇为有效的温补肾阳方（由生熟地各15g，菟丝子15g，补 骨脂15g，仙灵脾20g，巴戟天15g等组成，以下简称补肾方）进行研究，探讨温补肾阳法对 哮喘小鼠骨髓中Eos祖细胞向Eos分化及其调节因子的干预作用机制，具有较大理论意义， 有助于临床选方用药。1. Giembycz MA, Lindsay MA. Pharmacology of the eosinophil. Pharmacol Rev, 1999, 51: 213- 340. 2. Dorman SC, Sehmi R, Gau
9、vreau G M, et a1. Kinetics of bone marrow eosinophilopoiesis and associated cytokines after allergen inhalation. Am J Respir Crit Care Med, 2004,169(5):549-550. 3. 江荣林, 沈华浩. IL-5、Eotaxin与支气管哮喘. 国外医学呼吸系统分册,2004,24(1):l8-20. 4. Shen ZJ, Esnault S, Malter JS. The peptidyl-prolyl isomerase Pin1 regulate
10、s the stability of granulocyte microphage colony-stimulating factor mRNA in activated eosinophils. Nat lmmunol，2005,6(12):l280-l287.5. Bouchaib L, Soussi GA, Qutayba H, et al. The CCR3 Receptor Is Involved in Eosinophil Differentiation and Is Up-Regulated by Th2 Cytokines in CD34+ progenitor Cells.
11、The Journal of Immunology, 2002, 169: 537547. 6. Buitenhuis M. Baltus B. Singal transducer and activator of transcription 5a(STATSa)is required for eosinophil differention of human cord bloodderived CD34+ cells. Blood, 2003, 101(1): 134-l42. 7. 柯新桥补肾防喘述要湖北中医杂志，1997，19(6)：3 8. 沈自尹中西医结合防治支气管哮喘的探讨中国中西医
12、结合杂志，1995，15(7)：426 9. 倪伟，于素霞，王宏长，等缓解期哮喘患者肾阳虚与气道炎症关系的研究：附175例 病例分析中国中医基础医学杂志，20017(6)：60 10. 张炜，毕小利温补肾阳法治疗成人支气管哮喘急性期20例辽宁中医杂 志2002，29(12)：720 11. 张惠勇，倪伟，张金福，等喘可治注射液雾化吸入对调节支气管哮喘大鼠免疫失衡 的实验研究上海医学200326(12)：904 12. 许建华，吴敦序，方肇勤，等不同补肾法对哮喘大鼠肺组织p2肾上腺素能受体mRNA 的影响上海中医药大学学报，2001，15(3)：38 13. 许建华，范忠泽，吴敦序，等补肾定喘汤
13、对哮喘大鼠肺组织糖皮质激素受体及血浆皮 质酮、ACTH 的影响中国中医基础医学杂志，2003，9(1)：27（可另行附页） 四、项目研究内容四、项目研究内容（包括方法、技术路线、拟解决的关键问题及预期研究目标等）研究方法：研究方法：1.实验动物与分组本实验将健康10周龄的雄性BALB/c小鼠随机分为6组，即正常对照组、模型组、补肾方高剂量组、补肾方中剂量组、补肾方低剂量组和阳性对照组（地塞米松）6组，每组10只。2.复制模型采用卵白蛋白(OVA)雾化吸入致敏激发法复制哮喘小鼠模型。实验第 1d，将小鼠一次性腹腔注 OVA 混悬液 lml（OVAl00mg，氢氧化铝 100mg，灭活百日咳杆菌菌
14、苗 6X109个）以致敏，第15d 起，将小鼠分别置于 304040cm3大小的玻璃容器中，以 2%OVA 生理盐水溶液按最大雾化量进行超声雾化，小鼠自然吸入 20min，诱发哮喘。每天 1 次，共持续 7 天。以烦燥、挠鼻、抓身、咳嗽、喷嚏、呼吸急促深快及点头运动等症状的出现为激发成功。3.药物干预致敏后第 22 天开始给药，一日一次。补肾方组给药按高、中、低剂量分别为6g/kg、3g/kg、1.5g/kg 灌胃，地塞米松组给予地塞米松 5mg/kg 腹腔注射，正常对照组和模型组给予生理盐水 5mg/kg 灌胃。第 29 天，在给药同时，每日 2%OVA 生理盐水溶液雾化一次，持续 7 天。
15、4.标本采集 于末次激发后，用腹腔注射2%戊巴比妥钠2.3ml/kg麻醉小鼠，下腔静脉取血，收集至抗凝管中。取小鼠后肢股骨，用肝素化生理盐水(100u/m1)冲洗骨髓腔，直至骨髓腔呈白色，轻轻吹散细胞后过400目滤网使成单细胞悬液。待作流式细胞仪分析、细胞计数、制备细胞甩片及原位杂交结合免疫组化检测。肺组织以10%甲醛固定，以备病理检测用。5.指标检测（1）观察给药前后小鼠引喘潜伏期变化、烦燥、挠鼻、抓身、咳嗽、喷嚏、呼吸急促深快及点头运动等症状，判定哮喘症状轻重程度。（2）抗凝血直接涂片；骨髓悬液42000rpm离心10min，取沉淀物涂片，瑞氏-姬姆萨染色，进行白细胞和Eos计数。（3）固
16、定后的肺组织常规脱水，石蜡包埋，切片，行常规HE染色，观察肺中Eos浸润情况。（4）骨髓悬液离心后上清液用ELISA法检测IL-5和Eotaxin。（5）流式细胞仪检测骨髓CD34+造血祖细胞及CD34+/CCR3+细胞比例。取骨髓悬液,加入磷酸盐缓冲液(PBS)后离心去上清，调整体积为100l，加入CD34-PE和CCR3-FITC单抗10l；室温避光孵育20 min，加人500l红细胞裂解液，旋涡振荡器充分混匀；室温静置20min，加入PBS500l充分混匀，再静置20 min后上机检测。（6）原位杂交结合免疫组化方法测定骨髓细胞IL-5RmRNA及CD34的表达。骨髓细胞涂片经常规预杂交、杂交等操作后，采用链亲合素-生物素复合物-碱性磷酸酶显色系统，用5-溴4-氯-3吲哚磷酸/氮蓝四唑(BCIP/NBT)显色，阳性可见胞浆呈紫蓝色。杂交成功后立即行免疫组化染色，显色系统为过氧化物酶连接的链亲合素-生物素复合物，二氨基联苯胺(DAB)显色
