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1、L/O/G/OAntitumor effects of a novel benzonaphthofurandione derivative (8e) on the human colon cancer cells in vitro and in vivo through cell cycle arrest accompanied with the modulation of EGFR and mTOR signaling一种新型的苯并呋喃并萘二酮 衍生物（8e）通过调节表皮生 长因子受体(EGFR)和调节雷 帕霉素靶蛋白(mTOR)信号发 送从而诱导细胞周期停滞进而 对体外和体内的人结肠癌细胞
2、 产生抗癌作用细胞生物学20th论论文信息1.文章所刊登的学术杂志：Chemico-Biological Interactions (化学与生物相互 作用) 发表时间：2011年5月3日2.文章作者： 韩国首尔国立大学药学院 Hwa-Jin Chung， Sang Kook Lee 韩国首尔梨花女子大学药学院 Hee-Kyung Rhee，Hea-Young Park Choo3.关键词： 苯并呋喃并萘二酮衍生物 (Benzonaphthofurandione derivative) 癌细胞 HCL116 抗癌活性 (Antitumor activity) G0/G1期的细胞周期停滞 (G0/
3、G1 cell cycle arrest) 表皮生长因子受体/雷帕霉素靶蛋白信号发送 (EGFR/mTOR signaling)ppt结构1.Introduction2.Methods and results3.Discussions主要实验实验 流程1.测定对比8e和阿霉素对癌细 胞的增殖抑制效力（以半抑制 浓度表示），并用倒置相差显 微镜观察癌细胞前后形态2.用不同浓度的8e处理 癌细胞24h和48h，并用 流式细胞术分析癌细胞 的细胞周期分布4.提取第2步得到的癌细胞中与细胞 周期和信号转导相关的蛋白，并用 Western blot技术分析这些蛋白质 的表达水平，以推测8e的抑癌机理3.
4、将癌细胞移植到无胸腺小鼠身 上使其长成肿瘤，分析8e和阿 霉素对肿瘤生长的抑制效果，并 对肿瘤组织进行免疫组化分析1.Introduction背景：结肠癌是世界范围内的头号癌症杀手之一，每年有大约一百万 的新增病例。尽管全球结肠癌的发病率在逐步下降，但近年来由于饮 食习惯的西化，亚洲国家结肠癌患者数目显着上升。因此仍有必要开 发新型的抗结肠癌药物。阿霉素(Doxorubicin) ，一种蒽环类化合物，是临床上用来作为治疗 癌症的药物。 下面我们来看看8e和阿霉素(Doxorubicin) 的化学结构式。 8e的结构式阿霉素(Doxorubicin)【作用与用途】阿霉素是一种广谱 抗肿瘤抗生素，
5、可抑制RNA 和 DNA的合成，对RNA的抑制作用最 强，对多种肿瘤均有作用，属非周 期特异性药物，对各种生长周期的 肿瘤细胞都有杀灭作用。但有一定 的毒副作用。 【毒性反应】白细胞和血小板减少 ，约60%80%的病人可发生； 100%的病人有不同程度的毛发脱落 ，停药后可以恢复生长；心脏毒性 ，表现为心律失常， ST-T改变(ST 和T 分别指两种心电波)、恶心、食 欲减退；药物溢出血管外可引起组 织溃疡及坏死。另外，用药后尿液 可出现红色。2.Methods and results 2.1化学试剂（Chemicals）（略） 2.2合成8e （Synthesis of compound 8
6、e）：按已发 表的文献提供的化学合成方法人工合成。 2.3癌细胞的培养（Cell culture）：人结肠癌细胞 HCL116由美国模式培养物保藏所（ATCC）提供，用加 富的RPMI1640培养基培养，该培养基另外加入了10%热 灭活的胎牛血清（FBS），100单位/mL青霉素（盘尼西 林），100ug/mL链霉素，250ng/mL两性霉素B。置于 含5% CO2的控湿氛围中培养。2.4 8e和阿霉素对癌细胞抑制效力的测定：癌细胞HCL116(以1104 个/mL的密度植于96孔 盘)分别加入不同浓度的8e或阿霉素 (Doxorubicin)后置于37含5%CO2的控湿氛围 中培养72h。经
7、其他步骤处理后用570nm波长测 量吸光度以求得存活细胞的数量，并用非线性回 归分析的方法计算8e和阿霉素对癌细胞的半抑制 浓度（IC50）。8e和阿霉素对癌细胞的半抑制浓度，结结果计算结果表明阿霉素对癌细胞的半抑制浓度 为46.2 nm /L，而8e对癌细胞的半抑制浓 度为52.9nm/L，8e的抑癌效力稍逊于阿霉 素。用8e处理癌细胞24h和48h后用倒置相差显 微镜观察癌细胞的形态。虽然癌细胞存活的 数量随8e浓度增大而递减，但实验组的癌细 胞与对照组相比并没有明显的形态学变化。倒置相差显显微镜对镜对 8e处处理后癌细细胞的观观察结结果8e处理后癌细胞变得稀疏，但没有明显的形态学变化。2
8、.5 8e对癌细胞细胞周期分布的影响用磷酸盐缓冲液配制25、50、75nm/L的 8e溶液为实验组，并以磷酸缓冲液为空白 对照，分别处理癌细胞，在24h和48h后 用流式细胞仪分析癌细胞的细胞周期分布 。流式细细胞术术分析细细胞周期分布的结结果结果表明细胞周期停滞在G0/G1时期与8e的浓度有关2.6蛋白质质印迹分析将经过25、50、75nm/L的8e处理24和48小时后 的癌细胞的总蛋白质提取出来后，用聚丙烯酰胺凝 胶电泳（SDSPAGE）分离并电转移到聚偏二氟乙 烯薄膜上，薄膜用特制的缓冲液在室温下处理1h， 接着用以磷酸盐缓冲液稀释的特异性抗体进一步在 4下过夜处理。然后用特制的缓冲液洗
9、涤后，薄 膜在室温下用二抗标记的辣根过氧化物酶继续处理 2h，然后用荧光影像分析仪配合辣根过氧化物酶荧 光检测试剂盒来显像。蛋白质质免疫印迹分析图谱图谱 蛋白质质免疫印迹分析图谱图谱 2.7小鼠体内肿肿瘤生长长抑制实验实验实验采用6星期大的雄性无胸腺小鼠(athymic mice)。 在第0天将HCL116癌 细胞悬液皮下注射到每只小鼠的右侧腹部，当肿瘤体积长到9095mm3时（ 约在接种后第7天）开始用8e或阿霉素对小鼠进行治疗。 实验之前小鼠被随机分为6组（5个实验组和1个对照组），每组6只。 5个实验组：阿霉素3mg/kg/day,8e 2mg/kg/day ,8e 5mg/kg/day
10、 ,8e 10mg/kg/day ,8e (5mg/kg/day)阿霉素(3mg/kg/day) 8e和阿霉素分别溶于磷酸盐缓冲液并设置1个只有溶剂的空白对照。5组药物 都是以腹膜内注射的方式给药，每周3次，持续3周，每组共给药9次。小鼠体重和肿肿瘤体积积的变变化自接种癌细胞当天起，于第0、9、18、24、28天对小鼠 进行体重称量和肿瘤体积的测量。（在第28天实验结束可 以将小鼠身上的肿瘤摘取下来通过液体推排法测量肿瘤的 体积，但由于实验过程中在不能摘取肿瘤的情况下也要测 量肿瘤的体积，因此本实验中肿瘤体积的测量是通过较为 精准地测量肿瘤的长宽高，然后用公式（体积=长 宽 高 / 6）计算出
11、来的。不同时期的小鼠体重以柱状图表 示，肿瘤体积以折线图表示。小鼠与摘取下来的肿肿瘤小鼠体重的变变化肿肿瘤体积积的变变化与对照相比的肿瘤抑制率对肿对肿 瘤组织进组织进 行免疫组组化分析用抗Ki-67抗体对肿瘤组织进行免疫组化分析以检 测癌细胞的增殖情况。Ki-67是一种与细胞周期相 关的增殖细胞核抗原（PCNA）。 Ki-67是目前 多种恶性肿瘤尤其是乳腺癌研究中的热门生物标 志物，可以通过对Ki-67的检测了解恶性肿瘤的细 胞增殖活性。肿肿瘤的免疫组组化分析结结果分析结果表明8e抑制了增殖细胞核抗原Ki-67的表达 。小鼠治疗实验疗实验 的结论结论经过3周的药物治疗之后，10mg/kg/da
12、y的那 个实验组与对照组相比，肿瘤的抑制达到58.7% 。与对照组相比，实验组小鼠没有观察到明显的 体重变化和副作用。同时，免疫组织学分析表明 ，在异种移植的癌细胞中，8e抑制了增殖生物 标志物Ki-67的表达，表明8e的确有效地抑制了 癌细胞在体内的增殖。3.Discussion（重点）在最初的研究中作者发现8e对多种人类癌细胞系都 有生长抑制作用，而在固态肿瘤（实体肿瘤）中人 结肠癌细胞HCL116的生长对8e的抑制活性尤为敏 感。因此他们设计实验，从细胞周期调控蛋白的表 达和细胞信号传导途径两个方面进一步研究8e对人 结肠癌细胞的作用机理。cyclin与CDK的功能： 一般认为细胞周期蛋
13、白（cyclins）和周期蛋白 依赖性激酶(CDKs)是细胞周期的的调控者并通 过相互结合形成cyclin-CDK复合物来起作用。 在细胞周期的不同时期，不同的cyclin-CDK复 合物通过使特异的转录因子或其他蛋白质的磷 酸化，开启或关闭某些基因的表达，或直接调 节某些蛋白质的活性，从而推动细胞周期的更 替。但是癌细胞的细胞周期调控蛋白失控并导 致细胞的异常增殖。Part 1细细胞周期的一般模式G1/S检控点CDK4 、CDK6与 cyclinD形成的复合 物主要在G1期起作 用，促进G1/S转变CDK2 与 cyclinE形成的 复合物作用于S 期的起始阶段CDK2与 cyclinA形
14、成的复合物的作用 贯穿于整个S期CDK1与cyclinA或cyclinB（主 要是cyclinB )形成的复合物则 在G2/M转变中发挥作用G1/S转变转变 的调调控机理在细胞周期G1/S转变过程中，首先由cyclinD（D1、D2、D3）与 CDK4和CDK6结合形成cyclinD-CDK复合物，然后进入细胞核内， CDK的某些位点被CAK（周期蛋白依赖性激酶活性激酶）磷酸化。 磷化后具有激酶活性的cyclinD-CDK复合物使pRb-E2F复合物（ E2F是一种转录活化因子）中的pRb（视网膜母细胞瘤蛋白，一种 细胞周期抑制蛋白）磷酸化为p-pRb， 但pRb上有多个可磷酸化的 位点，仅仅
15、靠cyclinD-CDK对其进行磷酸化是不够的，随后还需要 cyclinE-CDK2继续对pRb上的其他位点进行磷酸化，以及 cyclinA/B依赖性激酶的活化来维持p-pRb的高度磷酸化状态。 p- pRb不具有与E2F结合的活性，因而释放转录因子E2F。被释放的 E2F进入核内结合一系列的基因启动区（c-myc、b-myb、cdc2等 ）促进这些基因的转录，使细胞通过G1/S检控点，从G1期进入到S 期。简简意图图促分裂信号CyclinD 水平升高CDK2CDK4cyclinD-CDK2cyclinD-CDK4pRb-E2F p-pRbpRb 磷酸化E2F活化相关基因的转录细胞通过G1/S
16、检控点 ，从G1期转变到S期cyclinE-CDK2继续磷酸化cyclinA/B-CDK维持高度磷酸化 不再结合E2F进入 核内增殖细胞核抗原 PCNAPCNA是一种由三个相同亚基组成的，总相对分 子质量为29kD的环状同源三聚体蛋白，在细胞 核内合成并分布于细胞核内，是真核生物DNA聚 合酶的辅助蛋白。 PCNA的三聚体环形结构环绕 着双链DNA，起到滑动发夹的作用，相当于原核 生物DNA聚合酶的亚基，极大地增强了真核 生物DNA聚合酶的持续合成能力，而且PCNA也 参与DNA的损伤修复。P21的抑制作用P21：一种细胞周期抑制蛋白p21可以与cyclin-CDK复合物结合从而抑制CDK的激酶活 性，进而使pRb不能维持磷酸化状态，而且cyclin-CDK的 其他一些生物学活性也不能实现。最终将无法转录一系列 与细胞周期时相转变（如从G1期转变为S期）相关的基因 ，从而导致细胞周期停滞。P21与PCNA结合可以抑制PCNA与双链DNA的连接，从 而抑制DNA的复制过程。8e对细胞周期调控
