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1、微生物学通报 MAR 20, 2012, 39(3): 318 325 Microbiology China 2012 by Institute of Microbiology, CAS 基金项目：国家自然科学基金项目(No. 31060128); 广西自然科学基金项目(No. 桂科自 0991078) *通讯作者：Tel: 86-771-2503995; : 收稿日期：2011-09-10; 接受日期：2011-11-22 研究报告 利用冰核蛋白 N 末端结构域在大肠杆菌表面 展示粘质沙雷氏菌脂肪酶 陶站华* 张搏 (广西科学院生物物理实验室 广西 南宁 530007) 摘 要: 【目的
2、】利用细胞表面工程技术将活性脂肪酶展示于大肠杆菌细胞表面并对展示脂肪酶的酶学性质进行研究。 【方法】将丁香假单胞菌冰核蛋白 N 末端结构域序列与粘质沙雷氏菌脂肪酶编码基因融合, 构建成脂肪酶表面展示载体, 并转化大肠杆菌 BL21 (DE3)。 【结果】重组菌以终浓度 0.05 mmol/L 异丙基硫代-D-半乳糖苷(IPTG)、25 C 条件下诱导培养, 16 h 后表面展示脂肪酶活力达到最大值 1 852 U/g 细胞干重。表面展示酶的最适pH为9.0, 最适反应温度为40 C, 表面展示酶热稳定性较游离酶有较大提高, 在40 C 孵育 1 h 后仍能保持 90%以上的酶活力。 【结论】以
3、上结果表明细菌表面展示技术为脂肪酶固定提供了一个很有前景的替代方法。 关键词: 表面展示, 脂肪酶, 粘质沙雷氏菌, 大肠杆菌 Display of Serratia marcesens lipase on surface of Escherichia coli using N-terminal domain of ice nucleation protein TAO Zhan-Hua* ZHANG Bo (Laboratory of Biophysics, Guangxi Academy of Sciences, Nanning, Guangxi 530007, China) Abstrac
4、t: Objective We constructed an Escherichia coli strain displaying an active lipase on the cell surface by cell surface engineering and characterized the displayed lipase. Methods Escherichia coli surface display vector of lipase was constructed by fusing sequence encoding the N-terminal domain of ic
5、e nucleation protein with Serratia marcesens lipase gene, and the 陶站华等: 利用冰核蛋白 N 末端结构域在大肠杆菌表面展示粘质沙雷氏菌脂肪酶 319 http:/ recombinant vector was transformed into Escherichia coli BL21(DE3). Results The highest lipase activity was observed when the recombinant cells were induced with 0.05 mmol/L iso- propy
6、-D-thiogalactoside (IPTG) and cultured at 25 C for 16 h. Optimal pH and optimal temperature for cell surface-displayed lipase was 9.0 and 40 C, respectively. The thermal sta- bility of surface-displayed lipase was improved compared with that of free lipase, and the re- sidual activity was above 90 p
7、ercent of initial activity after incubated at 40 C for 1 h. Con- clusion The above results suggest that the bacterial surface display technology offers a prom- ising alternative approach for immobilization of lipases. Keywords: Surface display, Lipase, Serratia marcesens, Escherichia coli 细菌表面展示技术是将
8、外源多肽或蛋白质与某些锚定基序融合, 融合蛋白在锚定基序引导下表达并固定于宿主菌细胞表面, 并保持原有的构象和生物学功能。细菌表面展示技术已在多个领域得到广泛应用, 如开发活疫苗1、构建和筛选蛋白文库2、 全细胞生物转化或生物催化3, 以及环境修复4等。目前已开发出多种锚定基序适用于不同的展示系统, 如在革兰氏阴性菌展示系统中, 可以选用外膜蛋白5、脂蛋白6、某些分泌蛋白7作为锚定基序; 在革兰氏阳性菌展示系统中可以利用葡萄球菌蛋白质 A 作为锚定基序8; 而对于古细菌, 则可以选用 S-层蛋白作锚定基序9。 冰核蛋白(Ice nucleation protein, INP)是丁香假单胞菌的外
9、膜蛋白, 包括 N 末端、C 末端和中央重复区共3个结构域, 研究表明INP全长序列、N末端和C末端结构域的嵌合体以及单独的N末端结构域都可以作为有效的锚定基序用于革兰氏阴性菌展示系统。 与其他锚定基序相比, INP 的优势在于它能稳定地在宿主细胞表面表达而不影响细胞膜的完整性, 此外基于 INP 的展示系统能展示较高分子量的外源蛋白, 如该系统曾成功展示分子量高达 60 kD10、77 kD11以及 90 kD12的外源蛋白。 脂肪酶(EC 3.1.1.3)是一类在水溶液中催化甘油三酯或其他脂肪酸酯水解, 在有机溶剂中催化酯类合成的酶, 脂肪酶催化的反应具有很高的底物特异性和区域选择性。粘质
10、沙雷氏菌脂肪酶是一种重要的工业用脂肪酶, 对一些有机溶剂具有耐受性, 可以应用于手性化合物的不对称合成, 如在化学-酶法制备地尔硫卓生产工艺中用于拆分消旋体反式-4-甲氧苯基缩水甘油酸甲酯得到(2R_3S)-4-甲氧苯基缩水甘油酸甲酯这一关键中间体, 具有广泛的工业应用前景和开发潜力。该酶在实际应用中通常是采用物理或化学方法将酶固定在适当的载体上, 然而固定过程可能造成酶活性损失或天然性质的改变。本研究利用 INP的 N 末端结构域作为锚定基序将粘质沙雷氏菌脂肪酶展示于大肠杆菌细胞表面, 并对展示酶的酶学性质进行了初步研究, 为粘质沙雷氏菌脂肪酶的固定探索出一种基于细胞表面工程的生物学方法。
11、1 材料与方法材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株和质粒: 大肠杆菌 DH5 及 BL21 (DE3)感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司, pET30a 载体为 Novagen 公司产品, 表达游离粘质沙雷氏菌脂肪酶的载体 pET-LipA13由本实验室保存。 1.1.2 工具酶和主要试剂: 限制性内切核酸酶Nde 、BamH 、Hind 和 T4 DNA 连接酶购自 New England Biolabs 公司, PrimerSTAR DNA320 微生物学通报 2012, Vol.39, No.3 http:/ 聚合酶购自宝生物(大连)有限公司, DNA marker购自天根生
12、化科技(北京)有限公司, 质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒为 BioFlux 公司产品, 截短的 INP 编码基因及 PCR 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成, 其他化学试剂均为国产或进口分析纯试剂。 1.2 方法 1.2.1 粘质沙雷氏菌脂肪酶表面展示载体的构 建: 构建表面展示载体所用的锚定基序为丁香假单胞菌冰核蛋白 N 末端结构域(179 个氨基酸), 其全长序列编码基因 InaK 的 GenBank 登录号为AF013159.1, 根据大肠杆菌密码子的偏好性利用 Graphical codon usage analyser 在线分析系统对其编码序列进行重新设计, 然后由上海生工生
13、物工程有限公司进行基因合成。合成好的基因经Nde和 BamH双酶切, 并与经过相同酶切的pET30a 载体连接, 构建成的大肠杆菌表面展示载体命名为 pINP。 然后以含有粘质沙雷氏菌脂肪酶基因的载体 pET-Lip 为模板, PCR 扩增获得粘质沙雷氏菌脂肪酶编码基因, 上游引物为: 5-CGCGGATCCATGGGCATCTTTAGCTATAAG GATCTG-3 (下划线部分为 BamH 酶切位点), 下游引物为: 5-CCCAAGCTTTTAGGCCAACAC CACCTGATC-3 (下划线部分为 Hind 酶切位点), PCR产物经BamH 和Hind 双酶切后, 与经过相同酶切的
14、 pINP 载体连接, 得到粘质沙雷氏菌脂肪酶表面展示载体, 命名为 pINP-Lip。构建好的质粒经酶切和测序验证以保证编码框正确。 1.2.2 表面展示酶 的诱导表 达: 重组载 体pINP-Lip转化于大肠杆菌BL21(DE3)中用于表达分析, 并以含有表达游离脂肪酶的 pET-Lip 载体的菌株作为对照。具体操作如下: 从平板上挑取单菌落接种于含有 50 mg/L 卡那霉素的 LB 液体培养基, 37 C 过夜振荡培养, 然后将培养物以2%的比例转接于 250 mL 含有 50 mL LB 培养基的摇瓶, 37 C、180 r/min 振荡培养至菌体密度OD600达到 0.6 时, 加
15、入终浓度为 2 mmol/L CaCl2 以及终浓度为 0.05 或 0.5 mmol/L 异丙基硫代-D-半乳糖苷(IPTG), 于温度为 25 C 或 30 C、摇床转速 180 r/min 条件下诱导培养 24 h, 每隔 4 h取 2 mL 菌液, 离心, 菌体沉淀用无菌水洗涤 2次后真空冻干, 称量干重后用适当体积的Tris-HCl 缓冲液重悬, 发酵上清液及菌体重悬液于 4 C 保存以备酶活力分析。 1.2.3 脂肪酶活力测定: 酶活力测定采用 p-NPP法, 参照 Tang 等14的方法稍作修改进行。A 液: 16.5 mmol/L 对硝基苯酚棕榈酸酯(p-NPP)的异丙醇溶液。B 液: 含有 0.4% Triton X-100 和 0.1%阿拉伯树胶的 100 mmol/L Tris-HCI 缓冲液(pH 9.0), 4 C 保存备用。 测定前, 将相应的 A 液与 B 液以l:9 (V/V)比例混和。 测定表面展示酶时, 取 100 L菌体重悬液加入 900 L 上述混合液中(空白对照管在混合液中加入 100 L Tris-HCI 缓冲液); 测定游离酶时, 取100 L粗酶提取液加入上述混合液中(空白对照管中加入 100 L 灭活的粗酶提取液)。 于 40 C 反应 10 min, 立即加
