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1、食品与发酵工业FOOD AND FERMENTATION I NDUSTRIES184? ?2011 Vol?37 No?1 ( Tota l277)双水相法萃取生姜蛋白酶体系的建立*谢芳1, 唐晓珍1, 马明1, 杜新永1, 卢会忠21(山东农业大学食品科学与工程学院, 山东 泰安, 271018)2(山东省莱芜市莱城区农业局, 山东 莱芜, 271100)摘? 要? 以生姜为原料, 研究了采用双水相萃取技术分离提取生姜中生姜蛋白酶的提取条件, 利用单因素试验与正交试验进行优化, 优化得到的萃取方案为: PEG 分子质量为 4 000 u, PEG 浓度为 30 % , 选择盐种类为(NH4
2、)2SO4, 浓度为 10% , 体系 pH 为 8?0。此双水相体系的生姜蛋白酶上相酶活力回收和纯化倍数都最高, 分别可达 393?77% 和 1?85 。关键词? 双水相萃取, 生姜蛋白酶, 酶活力, 分配系数第一作者: 硕士研究生 (唐晓珍教授为通讯作者 )。? * 山东省科技攻关项目 ( 2007GG30009002); 山东省自然科学基金项目 ( Q2004B01)收稿日期: 2010- 08- 25 , 改回日期: 2010- 10- 24? ? 生姜蛋白酶 ( EC 3?4?22?67)是从生姜中提取的 有蛋白水解活性的酶 1, 可用于肉类嫩化 2、 酒类澄清 3等。其提取分离技
3、术有超滤法、 盐析法、 有机溶剂法、 絮凝法、 亲和层析法等。然而, 生姜蛋白酶属大 分子物质, 超滤过程中易在膜表面聚积而产生浓差极化现象, 且生姜蛋白酶在有机溶剂中易变性以及存在有机溶剂残留等问题; 盐析法提取的生姜蛋白酶活性 较低, 与应用要求相差甚远; 絮凝法提取专一性不强,制得的生姜蛋白酶纯度不高; 亲和层析法提取的酶纯 度虽然较高, 但是操作复杂, 不易工业化生产。相对来说, 双水相萃取法能有效分离提取高纯度生姜蛋白酶。原因是双水相萃取具有两相界面而张力低, 有助 于保持生物活性和强化相际间的质量传递, 易于连续化操作, 具有目标产物收率高, 不存在有机溶剂残留, 分离过程经济等特
4、点。双水相萃取 (ATPS)技术是利用一种高分子聚合物和无机盐的混合溶液或两种水溶性不同的聚合物, 在一定浓度下将体系分成互不相溶的两相, 由于表面性质、 电荷间及各种作用力 (如憎水键、 氢键和离子 键 )等因素的影响, 使得目标蛋白酶和其他蛋白质在两相间的分配系数不同, 从而达到分离目的 4- 5。通过调整双水相系统中一系列参数就可选择性地萃取目标蛋白酶 6。本实验对成相物质组成、 浓度和萃取条件进行了初步探索, 建立了操作条件温和、 能耗低、 易放大、 可连续操作、 无有机溶剂残留、 简单可行 的分离提取生姜蛋白酶的方法。1? 材料和方法1?1? 试验材料生姜: 由山东省莱芜市莱城区农业
5、局提供。1?2? 仪器及试剂UV?2450型紫外分光光度计, 日本岛津公司; 80?2B型离心机, 上海医疗器械厂; JH?28型美菱榨汁、搅拌机, 美菱集团; JJ?1型精密增力电动搅拌器, 常州国华电器有限公司。TCA(纯度 99?0 % )、 EDTA(纯度 99?5 % ), 天津凯通化学试剂有限公司; 酪蛋白 (含氮 14?5% 15?5 % )、 考马斯亮蓝 G?250(分析纯 )、 L? 半胱氨酸(含量 98 % 102 % ), 上海化学试剂供应站; 各种聚 乙 二 醇 ( PEG800 、PEG1000 、PEG2000 、PEG4000 、PEG6000 、 PEG8000
6、), 天津巴斯夫化工有限公司; 生姜蛋白酶, 实验室提供; 其他为实验室常规试剂。1?3? 试验方法1?3?1? 生姜蛋白酶 (粗酶 )的提取取外形完好, 无机械损伤和腐烂的生姜, 切成小块, 与磷酸缓冲液 ( 0?03mol/L, p H7?5 , 内含 1mmol/LEDTA和 5mmol/L L? 半胱氨酸 )按料液比 ( g? mL) 1?2放入榨汁机中打浆, 所得浆液低速搅拌 20 m in , 并加入 20 % ( NH4)2SO4, 4层纱布过滤后, 滤液 4? 静置2h , 离心 ( 4 800 r/m in, 5m in)去除沉淀, 上清液用 1?5倍的无水乙醇进行沉淀, 再
7、次离心, 去除上清液后收集沉淀 (即粗酶 )。粗酶放置于冰箱中冷冻备用, 使用前将粗酶用上述磷酸缓冲液 1?10溶解并低温过滤。1?3?2? 双水相萃取将不同分子量的聚乙二醇和成相盐按质量比配分离与提取2011年第 37卷第 1期 (总第 277期 )185? ?制一系列不同浓度及 p H 的双水相体系。加入一定量的聚乙二醇和盐后用去离子水调系统总质量至 20g。充分溶解后倒入 60 mL的分液漏斗中进行分相,分相完成后再加 3mL的生姜蛋白酶粗酶液。将分液 漏斗封口, 反复倒置 2 3 m in , 每分钟 10 15次, 将体系各组分充分混合均匀后, 室温下静置分相 2 h , 使体系上下
8、相分离完全。测定上下相体积、 总蛋白质浓 度和生姜蛋白酶酶活力。1?3?3? 生姜蛋白酶活力测定 740? 水浴条件下, 酶促反应的前 5 m in降解酪蛋白产生 TCA(三氯乙酸 )可溶多肽, 在 280 nm下测多肽 的吸光值,以活性与灭活的生姜蛋白酶进行对照, 每增加 1 ?g /mL酪氨酸的值计量为 1个酶活力单位。标准方程为: y = 802?92 x - 9?521 2 , R2= 0?999 5 , 单位: U。 1?3?4? 蛋白质含量的测定 7采用 Bradford Protein Assay(考马斯亮蓝 G?250)法测定蛋白质浓度。标准曲线方程为: y= 97?142x
9、-1?2932 , 单位: ?g /mL。 1?4? 计算方法( 1)分配系数: 生姜蛋白酶的分配系数等于上下相各自酶活性值的比值 8。公式为:KE= Et/Eb E 是生姜蛋白酶的酶活力单位; 下标 t和 b分别代表上相和下相。蛋白质的分配系数 Kp的计算公式为: Kp= Pt/PbP 是蛋白质的浓度, 单位: ?g/mL。( 2)纯化倍数: 生姜蛋白酶提取相 (上相 )中的纯化倍数可用下列公式计算 8:PF= (Et/Pt) /(Ei/Pi)Ei是生姜蛋白酶原酶液的活性, 单位: units/mL;Pi是原酶液总蛋白质浓度, 单位: ?g /mL。 ( 3)酶活回收: 分相后酶活回收率的计
10、算公式是 9:R = EtVt/EiVi, %Vi和 Vt分别代表原酶液体积和上相体积, mL。 ( 4)上下相体积比:V= Vt/VbVt和 Vb分别代表分相后上相和下相的体积, mL。2? 结果与分析2?1?PEG分子质量的确定由图 1看出, 通过增加聚合物的分子质量, 上下相蛋白质分配系数 (KP) 呈逐渐下降趋势, 说明蛋白质随着聚合物分子质量的降低逐渐分配到富含该聚合物的相中, 这与高分子聚合物的体积排阻效应 8, 10有关。聚合物分子质量过高, 体积排阻效应增大导致生姜蛋白酶在相间的传递和在相中的扩散阻力大大增加, 不利于生姜蛋白酶进入 PEG相。 PEG平均分 子质量的减少, 虽
11、有利于总蛋白分配系数的增加, 但使生姜蛋白酶的选择性降低。为了平衡纯化倍数和酶活回收, 选择 4 000 u作为最佳的 PEG分子质量。图 1? PEG不同分子质量对生姜蛋白酶的萃取效果2?2? PEG质量分数的确定由图 2看出, 当 PEG质量分数很低时, 下相盐的盐析作用占主导作用, 使蛋白质主要分配在上相。当 PEG质量分数太大时 ( 25 % ), 酶活力分配系数(KE)、 蛋白质分配系数 (KP)、 纯化倍数 (PF)和酶活回收 (R, % )都处于很低水平, 说明当上相物质浓度太大时, 系统的表面张力增大, 溶质在相间的传递和 在相内的扩散阻力大大增加, 不利于生姜蛋白酶进入PEG
12、相。在 PEG浓度 25%处生姜蛋白酶有最大的酶选择性, 而且酶活回收和酶的纯化倍数也都较其他浓 度高, 因此综合选择 25%作为最佳 PEG浓度。2?3? 盐种类的确定选择 7 种 盐 类 Na H2PO4、Na2HPO4、KH2PO4、K2HPO4、 K3PO4、 MgSO4、 ( NH4)2SO4进行双水相体系 盐各类的选择, 在一定的质量分数下, 除了 KH2PO4外, 其 余 68 种盐 均 可成 相, 由图 3 知, 在 使 用食品与发酵工业FOOD AND FERMENTATION I NDUSTRIES186? ?2011 Vol?37 No?1 ( Tota l277)图 2
13、?PEG4000不同质量分数对生姜蛋白酶的萃取效果( NH4)2SO4的情况下, KP、 KE、 R和 PF均最高。而且使用 ( NH4)2SO4时上下相的体积比与其他盐相比处于较低水平, 有利于 PEG的回收再利用和降低成本。 这是因为 ( NH4)2SO4的水化能相比其他盐类来说都大, 分相能力强, 分相速度快, 而且用量省, 降低操作成本。因此选择 (NH4)2SO4作为最佳使用盐类。图 3? 不同盐种类对生姜蛋白酶的萃取效果2?4? 盐质量分数的确定当盐质量分数很低 ( 25 % )时,此双水相系统都不成相。太低时, 盐和 PEG互溶, 太高时, 盐易析出。由图 4可知, 盐质量分数低
14、于 14 %时, ?盐溶作用? 10起主导作用, 使得蛋白酶易分配到下相中去, 并在 10% 处有很高的蛋白质浓度和蛋白酶选择。随着盐质量分数的增大, ? 盐析作用 ? 10使得蛋白酶在上相中的分配系数逐渐增大, 并在 18 % 处到达顶峰。之后蛋白质浓度下降, 是因为盐质量分数过大, 系统表面张力增大, 导致蛋白质在相界面上吸附, 分配系数下降。当盐质量分数大于 8 % 时, 上 相的体积都很低而且呈缓慢下降趋势, 但在 10 % 处有最大的酶活回收。盐质量分数 6 % 处酶活回收虽然也很大, 但在此质量分数上相体积太大, 不利于酶的回收和 PEG的循环再利用。因此综合选择 10 % 作 为
15、合适的下相盐质量分数。图 4? 不同盐 ( (NH4)2SO4)质量分数对生姜蛋白酶的萃取效果2?5? 体系 pH值的确定由图 5可知, 随着 p H 值的增大, KE、 PF和 R 都呈现先增大后下降的趋势并都在 p H值 8处有最大值, 这进一步说明了该生姜蛋白酶属于酸性蛋白酶, 在酸度太大时容易产生沉淀, 酸度太小会导致萃取选择性降低。KP随 pH 值增大变化不大, 说明体系 p H 值的变化对蛋白质浓度的分配影响很小, 它主要影响上下相蛋白质分配种类的不同。由此可选择 p H 值 8作为最佳体系 p H 值, 但体系 p H值并不是主要的变化因素。2?6? 正交实验11根据以上单因素实
16、验结果, 选取 PEG分子质量、PEG浓度和 ( NH4)2SO4质量分数 3个因素作为正交实验的因素, 以 R (% )和 PF作为指标, 选择正交表分离与提取2011年第 37卷第 1期 (总第 277期 )187? ?L9( 34)进行正交试验。表 1? 双水相萃取生姜蛋白酶最佳提取方案因素水平表水平APEG分子量 /uB空列CPEG 质量分数 /%D( NH4)2SO4质量分数 /% 12 000301524 000201036 0002520图 5? 体系 pH对生姜蛋白酶萃取效果的影响? ? 由表 3方差分析结果可知, 以上相酶活力回收 R 和 PF为考察指标, PEG分子量和 (NH4)2SO4浓度 2个因素的 F 值均较大, 即对萃取结果影响均为极显著 (P A C, 即硫酸铵浓度 (% ) PEG分子量 PEG浓度 (% )。表 2?L9( 34) 正交实验结果试验号APEG分子量B空列CPEG浓度 /%D( NH4)2SO4浓度 /%R /%PF1111188?250?40212222
