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1、高效毛细管电泳测定鸡蛋中三聚氰胺饶钦雄1? 童 敬2? 郭 平3? 李海燕3? 李晓薇2? 丁双阳* 21(上海农科院农产品质量标准与检测技术研究所, 上海 201106)2(中国农业大学动物医学院 /国家兽药残留基准实验室, 北京 100193)3(中华人民共和国江西出入境检验检疫局, 南昌 330002)摘? 要? 建立了高效毛细管电泳? 二极管阵列检测器检测鸡蛋中三聚氰胺的方法。样品用三氯乙酸提取, 固相萃取小柱净化处理后进行检测, 以 50 mmol/L甲酸?50 mmol/L甲酸铵 ( pH 2. 5)为缓冲溶液, 在总长度为58. 5 c m, 内径为 75 ?m 的毛细管中, 分
2、离时间约 6 m in, 测得的定量限为 0. 25 mg/kg。三聚氰胺浓度在0. 25 5. 0 mg /kg范围内进行添加回收实验, 平均回收率为 80 . 2 % 90. 7% , 相对标准偏差 (RSD)为 1. 7% 3. 4 % 。本方法简单易行、 高效快速、 经济环保, 可以满足检测需要。关键词? 高效毛细管电泳, 三聚氰胺, 鸡蛋?2008?11?09收稿; 2009?03?23接受 本研究系国家? 十一五 科技支撑计划项目 ( No. 2006BAD31B09?2) 资助 *E? mai: l dingsy cau . edu . cn1? 引 ? 言从 2007年美国首发
3、的? 宠物毒粮 风波, 到 2008年的 ?三鹿奶粉 事件, 三聚氰胺已经引起了广泛关注。三聚氰胺, 又称氰尿酰胺 (在高温下可能分解为氰化物 ), 是生产塑料树脂的原料, 分子中含有大量氮元素, 不法分子为片面追求个人利益而将这种与食品毫不相干的工业原料引入食品中, 对人们的健康造成严重威胁 1。鸡蛋是日常食用最多的食品之一, 为保障鸡蛋的食用安全, 农业部最新颁布的鸡蛋中三聚氰胺的限量值为 2 . 5mg/kg。建立鸡蛋中三聚氰胺残留的检测方法是十分必要。目前, 检测三聚氰胺的方法主要有液相色谱法 2 5、 液相色谱 ? 质谱联用法 6 8和气相色谱 ? 质谱联用法 9, 10, 其检测样
4、品多为饲料, 鸡蛋中三聚氰胺的检测方法的报道较少。杨水平等 11报道了鸡蛋中三聚氰胺的表面解吸常压化学电离串联质谱法成像。毛细管电泳是近十几年发展起来的分离技术, 具有高效快速、 灵敏度高、 自动化高、 经济环保等优点, 已成为生物化学和分析化学领域中发展最快的一种 分离分析技术。本研究建立了鸡蛋中三聚氰胺的毛细管电泳检测方法, 操作简便、 分析快速、 稳定可靠且经济环保, 可作为鸡蛋样品中三聚氰胺测定的初筛方法。如果与质谱或电化学检测器联用, 可以获得更高的灵敏度。2? 实验部分2 . 1? 仪器与试剂HP3D高效毛细管电泳仪 (德国 Agilent公司 ) 配二极管阵列检测器; 拓展光程毛
5、细管柱 (总长64. 5 cm, 有效长度 56 cm, 内径 75 ? m, 德国 Agilent公司 ); W aters OasisMCX 固相萃取小柱 ( 3 mL, 60 mg); Effendorf 5804高速冷冻离心机 (德国 Effendorf公司 );Sartorius PB?21 p H 计 (德国 Sartourius公司 )。电泳缓冲溶液:50 mmol/L甲酸?50mmol/L甲酸铵 ( p H 2 . 5 , 色谱纯 ); 三聚氰胺标准品 (纯度 99%, Sigma公司 ), 用 V ( 20%甲醇 ) ! V(水 ) = 2! 8混合液溶解成 500mg /L
6、储备液; 三氯乙酸、 甲醇等其它试剂均为分析纯; 实验用水均为超纯水。 2 . 2? 鸡蛋样品的前处理生鸡蛋全蛋搅拌均匀, 准确称取 2 . 0 g , 加入 20mL 2 % 三氯乙酸溶液, 超声 10m in 、 振荡 10m in后,以 9000 r/m in离心 5 m in , 上清液过固相萃取小柱 ( SPE, 预先用 3mL甲醇和 3mL 水活化小柱 ), 自然流干后分别用 3 mL 水和 3 mL 甲醇洗涤, 抽干 SPE柱, 用 5 mL 5 % 氨化甲醇 ( V /V )洗脱。洗脱液在第 37卷2009年 9月? ? ? ? ? ? ? ? ?分析化学 ( FENXIHUA
7、XUE)? 研究简报Chinese Journal ofAnalyticalChe m istry? ? ? ? ? ? ? ? ?第 9期1341 134450 用 N2吹干, 以 500 ?L 20 % 甲醇? H2O复溶, 滤膜过滤后上机检测。熟鸡蛋用匀浆机充分匀浆后准确称取 2 . 0 g , 其余处理过程同生鸡蛋。 2 . 3? 实验方法毛细管电泳运行电压 25 k V; 0 . 35 kPa # 8 s进样; 检测波长 232 nm; 温度 25 。为提高分析的重现性, 毛细管在进样前用运行缓冲溶液冲洗 20m in ; 进样间用缓冲溶液冲洗 3m in ; 测定结束用 0 . 1
8、mol/LNaOH 冲洗 5 m in , 超纯水冲洗 10m in 。 三聚氰胺储备液用 20 % 甲醇 ? 水依次配制成 1 、5 、10 、20 、40、80和 100mg/L工作液, 每个浓度进样 3次, 以分析物的峰面积和浓度建立校准曲线。3? 结果与讨论3 . 1? 分离缓冲溶液的优化对柠檬酸? 柠檬酸三钠、 甲酸? 甲酸铵、 Tris碱? 盐酸、 乙酸 ? 乙酸铵和磷酸盐 5种缓冲溶液进行比较。结果表明, 分析物在后 2种缓冲溶液中峰展宽; 在前 3种体系中响应高、 峰形好; 但在 Tris缓冲体系中 信号不稳定; 而柠檬酸根因其在低波长有微弱的紫外吸收导致基线不如甲酸体系平稳,
9、 最终选择甲酸 ?甲酸铵为分离缓冲液。考虑到离子强度高导致分离时间延长、 但过低会影响分析物的响应, 所以选择50 mmol/L甲酸?50mmol/L甲酸铵。p H 是毛细管电泳分离的重要参数, 三聚氰胺 p Kb= 5 , 所以在 p H 2 . 0 3 . 5范围内进行考察, 得知 随着 pH增大, 分析物的迁移时间延长。结合实际样品谱图中的干扰峰, 在杂质峰不干扰药峰且分离时间最短的前提下, 最后选择 p H 2 . 5 。3 . 2? 仪器稳定性分析 在同样的分离条件下使用同一根毛细管柱, 对同一样品连续测定 3 d, 每天进样 6次, 测定其迁移时间和峰面积的相对标准偏差 ( RSD
10、s)。结果显示, 迁移时间的日内与日间 RSDs分别小于 0 . 3 % 和0?5 %; 峰面积日内与日间 RSDs分别小于 2. 0 %和 6 . 0 % , 说明本方法的重现性和稳定性均较好。3 . 3? 提取液的选择 由于三聚氰胺在 20%甲醇 ? 水溶液中溶解性较好, 乙腈又具有较好的沉淀蛋白作用, 所以比较了2 % 三氯乙酸、20 %甲醇?2 %三氯乙酸、20 % 乙腈 ? 2 % 三氯乙酸 3种提取液的提取效果。实验表明, 含有甲醇和乙腈的三氯乙酸提取液混浊, 过柱困难; 而用 2 % 三氯乙酸即可以达到很好的沉淀蛋白的作 用, 过柱顺利, 且回收率高。实验选择 2 %三氯乙酸为提
11、取液。3 . 4? 线性范围、 检出限、 回收率和相对标准偏差在上述电泳条件下, 三聚氰胺的峰面积与其浓度在 1 100 mg /L范围内呈线性关系, 其线性回归方程为 y= 6 . 4295x + 11 . 853(y为峰面积, x 为样品浓度 ),r= 0 . 9990 。 分别对 6个空白的生、 熟鸡蛋样品进行测定, 测得基线噪声平均值, 以 3倍信噪比 ( S /N = 3)为检出限 ( LOD), S /N = 6为定量限 ( LOQ), 得到三聚氰胺的 LOQ为 0 . 25mg /kg (见图 1和图 2)。对空白样品添加 0 . 25 、 2 . 5和 5. 0mg /kg三聚
12、氰胺进行回收实验, 每个添加水平平行 5次, 计算其 回收率和日内相对标准偏差, 连续测定 3 d , 计算日间相对标准偏差。结果见表 1 。表 1? 鸡蛋中三聚氰胺的添加回收率及相对标准偏差 Table 1? Average recovery and relative standard deviation( RSD) ofmelam ine spiked in eggs生鸡蛋 Raw eggs添加浓度 Spiked (mg /kg)平均回收率 Average recovery(% )日内相对 标准偏差 Intra?day RSD ( n= 5)日间相对 标准偏差 I nter?day RSD
13、 (n= 15)熟鸡蛋 Cooked eggs添加浓度 Spiked (mg /kg)平均回收率 Average recovery(% )日内相对 标准偏差 I ntra?day RSD ( n= 5)日间相对 标准偏差 Inter?day RSD ( n= 15)0 . 25 2 . 5 5 . 090. 5 90. 3 90. 73. 4 2. 8 2. 22 . 8 2 . 7 2 . 60. 25 2. 5 5. 081. 1 80. 2 81. 22 . 7 1 . 7 2 . 32 . 8 2 . 4 2 . 51342? ?分 析 化 学第 37卷? 图 1? 生鸡蛋 ( a)及
14、其添加 0. 25 mg /kg三聚氰胺后 ( b)的毛细管电泳图谱F ig . 1? Electropherogra m of blank raw eggs( a) and spikedsample at0. 25 mg /kg( b)1 . 杂质 ( i mpurities); 2. 三聚氰胺 ( melam ine)。? 图 2? 熟鸡蛋 ( a)及其添加 0 . 25mg/kg三聚氰胺后 ( b)的毛细管电泳图谱Fig . 2?Electropherogram of blank ra weggs ( a)andspiked sa mple at 0 . 25mg/kg ( b)1 ,
15、3. 杂质 ( i mpurities); 2 . 三聚氰胺 (melam ine)。3 . 5? HPCE法与 HPLC法的比较HPCE法兼有电泳和色谱双重技术的特点。HPCE分离效率 (理论塔板数为 106 107/m )比 HPLC法 (理论塔板数为 105/m)高, 且分离快速, 通常完成一次电泳操作 20m in ; 经相同的前处理后, HPCE 法比 HPLC对三聚氰胺的分离效果更好, 且分离时间约 6 m in (见图 3a和 b); HPCE样品消耗量 (进样量在 nL级 )比 HPLC(进样量在 ?L级 )少; HPCE比 HPLC经济环保, HPLC使用的色谱柱价格是毛细管
16、柱 ( Agilent)价格的几倍。此外 HPLC分析一个样品, 时间越长消耗流动相越多 (通常含有机相 ), 不仅 价格昂贵, 而且给环境造成严重的危害。而用 HPCE检测一个样品只需 1mL缓冲溶液 (全为水相 ), 价廉易得, 对环境几乎无污染。当然由于 HPCE进样量少、 毛细管柱内径小、 光程短 ( CE检测窗口仅为液相检测池的 1/20), 此外 CE采用紫外检测器, 严重限制了它的灵敏度。王浩等 4以 HPLC测定宠物食品中三聚氰胺, 经醋酸溶液提取后, 部分提取液经混合阳离子交换小柱 (MCX)净化, 其方法的定量限为 0 . 5mg/kg。国标 GB /T 22388? 2008 , 乳制品中三聚氰胺检测方法, 采用三氯乙酸溶液和乙腈提取, 同样使用 MCX净化, HPLC法的定量限为 2 mg/kg 。上述方法的前处理以及分析时间与本方法相近, 但定量限比本方法高 ( 0. 25mg /kg), 这主要与其稀释程度有关 (文献 4将样品稀释 3倍 ), 而本实验采用浓缩 的方法 (浓缩 4倍
