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1、http:/ - 1 - 优化逆转录病毒载体转导优化逆转录病毒载体转导 T 细胞受体基因细胞受体基因 牟艳芳，张巨峰，张文峰，邵红伟，黄树林 广东药学院广东药学院生命科学与生物制药学院，广州 (510006) E-mail: 摘摘 要要: 逆转录病毒载体转导 T 细胞受体（TCR）基因进 T 淋巴细胞，可以潜在的影响 T 细胞识别抗原的能力为有效的特异性免疫治疗开辟新的途径。提高转录病毒载体转导 TCR 基因的转染效率和表达水平为以后临床应用有深远影响。本文从 TCR 基因和逆转录病毒载 体两个方面，不同的方法进行综述。 关键词：关键词：T 细胞受体；逆转录病毒载体；基因转导 抗原特异性 T
2、 细胞的过继性转导在治疗肿瘤和病毒性疾病方面很有前景。1-2T 细胞受体（TCR）基因转导进 T 淋巴细胞可以潜在的影响 T 细胞识别抗原的能力，转导高活性的 TCR 基因可以成功地将肿瘤的特异性转导到非肿瘤活性的淋巴细胞。T 细胞的特异性主要由 TCR 决定的，TCR 基因转导可以为肿瘤特异性 T 细胞的转导提供另一条途径。目前在TCR 基因转导过程中最常用的是逆转录病毒作为载体。3逆转录病毒介导基因的高表达对于基因治疗来说是非常关键的特别是当生物效能的发挥主要依赖于转导基因的表达量， 因此提高转导 T 细胞受体基因的转然效率和表达水平对于疾病的治疗及以后临床上的应用都是非常重要的。 1 T
3、CR 基因基因 TCR是T细胞表面识别抗原的分子， 现已知道参与TCR组成的共有4条肽链即、 、 和。人类外周血95%T 细胞表达/TCR, 3% 5%T 细胞表达/TCR 4 。 TCR 的V 区同免疫球蛋白V 区有类似的结构特点: 、 链的可变区各有3个高变区,又称互补决定区(complementary determining region ,CDR) ,即CDR1、CDR2 和CDR3。TCR 与MHC-多肽分子结合形成TCR-MHC 多肽复合物, 其中CDR1、CDR2 主要与MHC 分子相结合,CDR3 直接与抗原肽结合5 。由于CDR3在T 细胞成熟过程中基因重排, 从而产生了TC
4、R的多样性, 为T细胞三分子复合物识别不同的特异性抗原奠定了分子基础6 。 逆转录病毒是第一个被允许用于用于临床的载体 7 ，也是广泛用于实验室研究和临床试验的载体。8 将特异性TCR基因与其重组,经包装细胞包装后,形成具备感染能力的新病毒颗粒， 理论上它能转染几乎100 %的靶细胞,且能整合到基因组中获得稳定而长期的表达,但实际的转染效率远低于此,转染人外周血分离的CD4+ 和CD8+ T的效率只有6%-9%9。 要提高TCR基因的转染效率和表达水平可以从三方面进行，改善TCR基因水平修饰及逆转录病毒载体方面和转染方法。 2 TCR基因方面基因方面 2.1 密码修饰基因密码修饰基因 近年来,
5、有些国外学者通过优化修饰基因密码来加强抗原基因在特定细胞中的表达。此类研究在HIV、HPV 等病毒DNA 疫苗的研究中取得可喜进展10 ,11,在鼠体内试验，通过密码修饰病毒蛋白的DNA疫苗，CTL应答和抗肿瘤活性也显著提高12。 Scholten 等通过密码修饰人TCR的，基因，然后通过逆转录病毒LZRS转导进CD8+ T细胞。通过密码修饰的TCR的，基因与野生型的T CR的，基因在CD8+ T细胞中的表达http:/ - 2 - 比较，发现前者比后者的膜表达水平显著提高，前者为54%，后者为6%。此外转染的T淋巴细胞稳定的表达引入的TCR近4个月的时间且保持较高的活性，可以为以后以TCR转
6、染为主的免疫治疗的临床应用提供更好的基础.13 2.2 改变竞争关系改变竞争关系 TCR基因转导进T细胞后再膜上表达较少，主要是由于引入的TCR基因必须与内源的TCR以及引入与内源的基因形成的嵌合体TCR复合物竞争与CD3分子结合， 所以通常引入的TCR基因比内源的TCR在膜上表达较低。近年来，许多学者通过实验解决了此类问题。 通过用SiRNA可以抑制内源的TCR的或基因的表达。 如前面所述密码修饰的TCR与内源性TCR序列不同，SiRNA可以设计以去除内源性TCR的特异性。McManus14等通过用CD4/CD8SiRNA电转到鼠初始T淋巴细胞，持续3天观察，流氏分析转染48h大约70%的细
7、胞出现沉默，CD4/CD8表达明显下降。初始T淋巴细胞对RNA干扰敏感，为以后进一步研究T淋巴细胞的生物学功能和以后的基因治疗提供基础。 TCR异源二聚体形成特异性信号引入TCR链以加强表达和形成为唯一配对。 细胞膜上CD3蛋白的表达可以促进T细胞的活化15，Willemsen16等通过将HLA-A1特异性，MAGE-A1抑制性CTL克隆MZ2-82/30的和基因 构建含CD3的嵌合体双链TCR VC和 VC (tcTCR/),将tcTCR用逆转录病毒载体转导进人初始T淋巴细胞结果其在膜上不表达， 证明嵌合体TCR或TCR与内源性的TCR链或TCR链不能结合， 对转导tcTCR/的T细胞用荧光
8、标记的TCRV和V特异性单克隆抗体作用，发现细胞内TCR和表达一致，指出引入的TCR/链唯一配对，同时流氏分析嵌合体双链TCR稳定的表达。 3 逆转录病毒载体逆转录病毒载体 3.1 构建新载体构建新载体 pBullet 载体包括莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)包装信号，供体和受体RNA剪接位点，最佳蛋白翻译起始方向新基因引入得多克隆位点17。pBullet 载体的构建在LXSN的5LTR的U3区被CMV-IE启动子取代已增加RNA的表达， SV40区可以产生大量含SV40 T蛋白的病毒颗粒，将pBullet 载体引入293T细胞，可产生高滴度的病毒。PStitch载体含有供体和受体剪接位点，5
9、逆转录病毒gag序列为转基因更好的转录和包装，如MGF逆转录病毒载体一样，还含有CMV-IE启动子和SV40起始区。此载体需要pHIT60和pCOLT-GALV辅助转导进活化T细胞后有高转染效率和转基因的高表达。但这两种载体只能产生短暂的高转染和高表达。18 Engels 等19将TCR的，基因通过逆转录病毒转导进人初始T细胞，发现在相同的病毒滴度下，以MPSV为基础载体转导基因在T淋巴细胞比以MLV为基础的载体有高转染效率和高TCR表达。MP71载体也是很好的工具，转导TCR基因在T淋巴细胞内产生稳定和高水平的表达。通过比较MP71载体与Mo-MLV载体转导基因在T淋巴细胞的表达，所有的载体
10、都带有GFP以检测转基因的表达水平，发现MP71载体有高达75倍高GFP的表达，同时Mo-MLV载体最高的MOI值比MP71载体最低的MOI值还要低 20 。此外一些构建的其他载体例如pCMMP-IRES-GFP,当TCR基因嵌合体插入载体中，与传统的载体相比，病毒滴度由vs 6.43x109 VP/L 上升到2.15x1011 VP/L, 转染效率由5%-10%上升到50%-60% 21。 http:/ - 3 - 3.2 转染方法改善转染方法改善 通常逆转录病毒转染效率较低是由于是逆转录病毒只能转染正在分裂的细胞22 ，所获得的逆转录病毒滴度较低,逆转录病毒半衰期短,37 时只有58 h
11、,而且移动距离有限,在一个半衰期内距靶细胞480610m 以上的大多数病毒不能到达靶细胞23。 3.2.1改善病毒颗粒产生条件改善病毒颗粒产生条件 通过药物作用细胞以改善病毒颗粒产生的条件。通常用丁酸钠和曲古抑菌素A均是去乙酰化酶(HDAC) 抑制剂,前者是人类结肠中细菌发酵碳水化合物产生的一短链脂肪酸;后者是抗真菌药物。二者可抑制HDAC 的活性, 导致组蛋白乙酰化程度升高。升高的乙酰化组蛋白可以增强相关基因的转录。 Chris等用曲古抑菌素A和丁酸钠分别处理包装细胞y2/LIG/NGF24h后，产生的病毒上清感染NIH3T3细胞，结果发现曲古抑菌素A与阴性对照相比病毒滴度增加34倍，而与丁
12、酸钠相比病毒增加了3.4倍。24 3.2.2 加强病毒与巴细胞之间的相互作用加强病毒与巴细胞之间的相互作用 1 通过离心及改变温度提高病毒半衰期的方法 Kotani 等23 在逆转录病毒转导的最佳方法的研究中发现37的非活化的逆转录病毒载体比32时要多，32与37相比滴度增加5-15倍，34位于中间。在逆转录病毒载体转导的研究中，病毒上清和靶细胞低温离心，转染效率明显增加。Bunnell等25将逆转录病毒载体转导基因进入人外周血淋巴细胞， 通过三种不同的转染方法， 发现病毒上清与靶细胞在32，1000g离心60min，而后再32培养12h，转染效率明显升高，PG13包装细胞产生的病毒转染效率4
13、5%80%，PA317包装细胞产生的病毒转染效率20%40%。 2 增加粘附 近年来，很多研究人员通过用polybrene来增加病毒与靶细胞之间的粘附来提高转染效率，但是结果并不理想。重组人纤维连接蛋白fibronectin的应用，也提高了病毒与靶细胞之间的粘附作用。Morgan等26用逆转录病毒载体转导TCR基因进入人初始淋巴细胞，用25.5ug/ml重组人纤维连接蛋白fibronectin辅助作用， 转染效率超过50%。 Lamcers和Wille等27通过用fibronectin片断CH-296与polybrene进行比较，运用相同的载体转导基因到T淋巴细胞，前者的转染效率为40%而后者
14、仅为8%，转染效率明显升高。 3 磷酸盐耗竭法 磷酸盐耗竭法也可用于提高转染效率，此方法可以增加RNA的产生。Bunnell等25在转染靶细胞之前，对淋巴细胞进行处理，用不含磷酸盐的1640培养基代替原培养基，在37培养312h，然后用病毒感染，这种磷酸盐饥饿方法，基因的转染效率超过25%而正常方法仅为2%。 此外， Chuck 和Palson等28 则采用流动转染法(Flow through transduction) ,使病毒上清以恒定速度流过一半透膜,将转染效率提高到90 % ,并且对病毒滴度的要求大大降低,也不必再用polybrene 来辅助转染。 3.2.3 浓缩病毒浓缩病毒 提高转
15、染效率，病毒上清的浓缩也是不可缺少的。减少病毒上清的体积而同时又要保留病毒的感染力可以通过高速离心的方法，同时还可以避免感染抑制剂的浓缩，VSV-Ghttp:/ - 4 - 载体可以50000g/90min,病毒滴度高达2000倍，70%左右的回收率。29 磷酸钙共沉淀法也可以浓缩病毒上清，MLV的包装糖蛋白，表面单位和跨膜区不是共价结合的，高速的离心极易分离，引起含有MLV包装糖蛋白的MLV逆转录病毒感染力的缺失，Pham等30用60Mm氯化钙，2000g离心，少量的EDTA盐重悬，通过透析除去EDTA，使病毒上清体积由300ml浓缩到10ml，病毒的回收率50-100%，滴度达到1000倍。 病毒感染靶细胞静止培养时，大约90%的病毒不能感染靶细胞，为了充分利用病毒进行感染，可以用高密度的粒子低物。病毒上清与低物混合形成复合物，因密度大，在培养基中沉积，使病毒保持在半衰期内，病毒与低物结合，但仍有感染力，不需特别处理使其释放，而且对细胞没有毒副作用，使其有足够的时间满足病毒与靶细胞作用。Darling等31用甲醛固定的金色葡萄球菌Pansorbin加入PG13包装病毒上清中，离心使病毒浓缩，病毒滴度上升到7500倍，而因体积减少损失的只有200倍。Pansorbin与病毒的结和使其浓缩，而且忽略其编码的基因。
