纤维素酶活力的测定

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1、生物化学实验报告生物化学实验报告 题目：纤维素酶活力的测定题目：纤维素酶活力的测定 -3、5二硝二硝基水杨酸法基水杨酸法 姓名：余振洋姓名：余振洋 学号：学号：200900140156 系年级：系年级：09 级生科级生科 3 班班 同组者：张刚刚同组者：张刚刚 时间：时间：2011/4/22 一、【实验目的】一、【实验目的】 学习和掌握 3、 5二硝基水杨酸 （DNS） 法测定纤维素酶活力的原理和方法， 了解纤维素酶的作用特性。 二、【试验原理】二、【试验原理】 纤维素酶水解纤维素，产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖，能将 3、5-二销基 水杨酸中销基还原成橙黄色的氨基化合物,在 550nm 波长处

2、有最大光吸收，在一 定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系， 利用比色法测定其还原糖 生成的量就可测定纤维素酶的活力。 酶活力也称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力的大小可 用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶 活力愈高，反之活力愈低。测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。酶促反应 速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。在一般 的酶促反应体系中，底物往往是过量的，测定初速度时，底物减少量占总量的极 少部分，不易准确检测，而产物则是从无到有，只要测定方法灵敏，就可准确测 定。因此一般以测定产物的增量来表示酶促反应速度

3、较为合适。 实验中实验中定义定义： 1mg 酶每分钟水解生成 1 微克葡萄糖的量定义为 1 个酶活力单 位。 NOD 值对应的葡萄糖量 纤维素酶活力单位 30L N酶液的稀释倍数 30糖化所用时间 L反应酶液毫升数 三、 【试验器材】三、 【试验器材】 比色管 10 支，5ml 移液管，移液枪，500ml 大烧杯，水浴锅，电炉，搅拌振荡 器，722 型或其他型号的可见分光光度计。 四、 【实验试剂】四、 【实验试剂】 1 酶液：酶液： 将 0.05g 酶溶解定容至 50ml， 从中取出 1ml 再定容至 100ml， 待测 （用 PH4.5 乙酸乙酸钠缓冲溶液配制） 。 20.1mol/L P

4、H4.5 的乙酸-乙酸钠缓冲溶液。 33、5二硝基水杨酸显色液：二硝基水杨酸显色液：称取 10 克 3、5-二硝基水杨酸，溶入蒸馏水中， 加入 20 克分析纯氢氧化钠，200 克酒石酸钾钠，加水 500 毫升，升温溶解后， 加入重蒸酚 2 克， 无水亚硫酸钠 0.5 克。 加热搅拌， 待全溶后冷却， 定容至 1000ml。存于棕色瓶中，放置一周后使用。 40.5%羧甲基纤羧甲基纤维素钠维素钠（CMC）水溶液水溶液，溶解后成胶状液，静置过夜。使用 前摇匀。 5标准葡萄糖溶液：标准葡萄糖溶液：称取干燥至恒重的葡萄糖 100 毫克，溶解后定容至 100 毫 升，此溶液含葡萄糖 1.00mg/ml。

5、五、 【实验操作】五、 【实验操作】 1标准曲线的绘制：标准曲线的绘制：取 6 支比色管，分别加入葡萄糖 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、 1.0 ml，再分别加入去离子水稀释至 1ml，然后分别加入 3、5二硝基水杨酸显 色剂 3ml，在沸水浴中煮沸显色 10min。冷却后定容至 25ml，在 550nm 下测 OD 值。以光密度为纵坐标，以葡萄糖微克数为横坐标，绘出标准曲线。 2空白管空白管：取 1ml 酶液，沸水浴 5 分钟，冷却后加 3ml0.5%CMC。 3样品管样品管：取三支比色管，分别加入 3ml 0.5%CMC 和 1ml 酶液，混匀，与空 白管同时放入 50水浴锅中水

6、浴 30min。到时间后，将比色管取出，再沸水浴 10min，使酶失活，得糖化液。冷却后加入 3ml 3、5-二硝基水杨酸显色液，再沸 水浴 10min。冷却后定容至 25ml，混匀，与标准曲线同时在 550nm 下测 OD 值。 4根据所做的图计算 1g 固体酶的活力。 六、 【注意事项】六、 【注意事项】 1分光光度计在使用前应进行预热 30min，使其发光稳定，且在无样品放置时， 使试样室盖打开，以保护光电管。 2测定时，调零用的 1 号管液一定要在相应的各管液测定完成后，方可从比色 杯中弃掉。 3用移液管或加液器加各试剂时，不能将移液管或取液枪头混用。 4使用比色管时要将其擦拭干净，应

7、用吸水纸吸去比色管表面溶液，用擦镜纸 擦拭，以避免对比色管光滑面造成磨损。 5在标准曲线制作时，应从低浓度到高浓度以此测量，因为低浓度的残留液对 高浓度待测液的测定不会有太大影响，所以可不用润洗比色管，但若有高浓度到 低浓测定，则需要对比色管进行润洗，以消除误差，因为高浓度残留液会对低浓 度的溶液浓度造成很大影响。 七、 【实验结果】七、 【实验结果】 表一表一 葡萄糖标准曲线制作葡萄糖标准曲线制作 管号管号 1 2 3 4 5 6 葡萄糖标(ml) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水(ml) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 定容后总体积(ml) 25 25

8、 25 25 25 25 光密度 OD550nm 0.000 0.104 0.215 0.335 0.440 0.544 试剂试剂 表二表二 纤维素酶光密度的测定纤维素酶光密度的测定 管号管号 空白管 样品管 1 样品管 2 样品管 3 酶液(ml) 1.0 1.0 1.0 1.0 CMC(ml) 3 3 3 3 显色液(ml) 3 3 3 3 定容后总体积(ml) 25 25 25 25 光密度 OD550nm 0.000 0.470 0.466 0.463 绘图：绘图： 计算：计算： 三个样品管平均光密度为（0.470+0.466+0.463）/ 3=0.466，从图上找到对应的葡 萄糖数

9、为 0.86mg，所以纤维素酶活力单位 = - =（1000.86103）/30 = 2.87103ug/mgmin 所以 1g 固体酶的活力= 2.871031000 = 2.87106 u 试剂试剂 NOD 值对应的葡萄糖量值对应的葡萄糖量 301 八、 【结果分析及讨论】八、 【结果分析及讨论】 1分析分析 从图像可以看出来， 所有的点并非全在一条直线上， 造成这一误差的原因有： 1、溶液在定容后未摇匀，造成各处浓度不均一，最终影响 OD 测量值；2、使用 的比色杯不是同一套的或者使用前未洗净；3、空白管的沸水浴时间不够，导致 酶未完全失活，影响调零；4、操作中的偶然误差。 2讨论讨论 两个空白管是否有需要设立？若需要则两个空白管是否有需要设立？若需要则解释解释其有什么作用？其有什么作用？标准曲线是否需要标准曲线是否需要 过原点？过原点？ 答： 两个空白管都需要设立。酶失活空白管的设立是为了排除酶和纤维素与显色 剂发生反应所产生的影响。常规的 100沸水浴灭活酶并不彻底，残留酶活形成 的空白值会导致测定结果产生较大的负偏差。 于是建立了这种简便可靠的空白实 验方法：以底物空白与酶液空白的算术和作为总空白处理，其酶活测定偏差小于 2。 同时实验要在规范的测试条件下测定酶活， 其测定结果符合 LambertBeer 定律，且具有可比性，因此曲线需要经过原点。