柱前衍生高效液相色谱法测定氨基酸梁冬生常碧影（ 国家饲科质量监督检验测试中心， 北京 1 0 0 0 8 1 ）自 从M o o r e 等 提出 色谱 法定 量分析氨基酸以 来， 传统的离子交换色谱及柱后茚三酮衍生检测方 法始 终占着主导地位 三十多 年来， 人们 对该法及仪器做了大量的研究与改进工作， 使分析的灵敏度、 速 度以及白自 动化程度有了 很大的进步， 而且以此为 基础， 建立 了食 品、 饲料等有关基酸分析的一系 列 国际和国家标准 然而， 随着氨基酸分析应用领域的 扩展， 氨基酸测定仪用途单 一 、 结构复杂、 价格贵 等缺点日 显突出 自 七十 年代以来， 随着高效液相 色 谱的发展， 特别是键合反相 色谱的应用及柱前衍生 技 术的发展， 为氨基酸分析提供了广阔的前景 目 前不少方法已 趋于成熟， 并且逐步被临床化学、 蛋白 质化学、 生理研究以及食品、 饲料营养分析者所认 可 与 采用 这些方法大多具 哂 有衍生操作简洁, 徊产生或 易于 排除干 扰物、 色谱分离分辨率高， 灵敏度高， 分析时间短以及仪器简单、 也可一机多用等优点 但也 有各自 的欠缺与 不足 本文就是根据我们的经验及 有关的文献[ 4 5 ] ， 对前应用 最广、 影响 最大的几 种 柱前 衍生反相高 效液相色谱测定氨 基酸的方 法— —邻苯二甲醛( O P A ) 法、 氯甲酸药甲酯（ 或叫9 - 芴基甲氧基羰酰氯 F MO C 法、 异硫氰酸苯酯( P I T C ) 法和丹酰氯( 即 二 甲氨基萘磺酰氯 D a n s y l- C i ) 法进行讨 论 和研究， 介绍它们的基本原理、 特点， 列出各自的 色谱图 和有关数 据（ 与离子色谱法比 较） 等。
一、 邻苯二甲醛 O P A） 法邻苯二甲醛( O P A ) 衍生法， 早在1 9 7 1 年就由 R o t h 提出， 由 于其灵敏度比茚三酮法高出十 倍， 故最初作为一种柱后衍生剂， 后来才作为柱前衍生剂 使用 J o n e s 等( 7) 提出的衍生方法如 下 ：O P A在2 - 巯基乙醇存在下与第一级氨基酸迅 速反应生成1 - 硫代- 2 - 烷基异叫哚(8 ) ， 加成物可产生荧光， 在紫外区有较强吸收 它可做高灵敏度荧光检 测， 又可做一般的紫 外吸 收检测 紫外检测线性范围为1 0 －2 0 0 p m o l荧光为0 . 8 -1 5 p m o 1 O P A 本身不 干扰分离与检测， 不 必除去 过量试剂， 色谱图基线也 比较平稳 图1 为O P A衍生法测定蛋白水解液的色谱图 O P A柱前衍生反 相H P L C法比 传统柱后衍生 有更高的分辨率和灵敏度( 9) 多数氨基酸检测极限为0 . 5 p m o l （ 以信噪比 2 . 5 ： 1 计） ， 只 有组氨酸和赖氨 酸较高， 分别为2 . 5 和3 . 5 p m o l O P A法蛋白水解液 变异系数一般为2 - 3 . 4 % ( C V ) ， 生理体液为4 7 %（ 手动 衍生o f f - li n e ) 酪氨酸和组氨酸的 大些， 为 8 -1 0 % 表1 给出了O P A等方法测定结果与理论 值的比较。
O P A法最大缺点是： 1 ． 不能与带有仲氨基团的 脯氨酸或羟歉脯氨酸反应， 因此做全谱分析时需配以 其它技术（ 如与F M O C 衍生剂一起使用) . 赖氨酸及胱氨酸衍生物荧光较弱， 灵敏度低， 近年来有人 提出加 B r i j 3 5 和碘乙酸酯使其灵敏度提高 3 . O P A的 氨基 酸不稳定， 特别是甘 氨酸、 赖氨酸衍生物的信 号 衰减很快， 此法多用于全自 动的衍生( o n - li n e ) 4 . O P A法分析配合饲料氨基酸回收率较低， 这可能 是配合 饲料中的盐分影响了 衍生(l0 ) 二、 氯甲酸药甲醋( 9 - 药基 甲氧基狱酞氯, F MO C )氯甲酸药甲 酯ナ 是多肽合成的氨基保护剂 它能 与 带有伯、 仲氨基团的氨基酸反应， 生成衍生物可 被 反相高压液相色谱分离 衍生物又具有 荧光（ 也有 紫 外吸收） ， 使F M O C逐步成为 一 个氨基酸分析中 新 型柱前衍生剂 该方法是J o s e fe s s o n ( 1 1 )提出的， 反 应 式如图3 所 示 F MO C与 氨基酸反应迅速， 室温下约3 0 s 即可 完成 反应产物稳定， 在4 避光条件下可储存1 3 天之久， 在酸性条件下也可稳定3 0 h以上。
反应有很高表1 蛋白水解 液( 6 m o l / L H C l 2 4h ) 理论值与测定值比较（ 参考文献[ 2 6 ]的灵敏度， 检测极限为1 p m o l （ 信噪比为2 . 5 : 1， 可与 O P A法相媲美 色谱分离中有很好的分辨率和分离 速度（1 2, 13 ） F M O C法最大优点是不受样品基质的干 扰（ 如盐分） 图2 为F MO C 法分析蛋白水解液色谱图 F M O C法蛋白 水解液的结果变异系数一般为 2 -3 %， 只 有组氨酸变异系数较大， 为8 -9 %， 生 理 体液变异系数为3 -5 %， 测定结果均与传统离子色 谱法和理论值相 近（ 见表1 ） F M O C柱前衍 生反相 H P L C法的缺点是， F MO C在衍生过程中易产生试剂的水解反应， 过量 的F M O C 与其水解产物均有和F M O C - 氨基酸类似的荧光， 一般需在上机前萃取净化 最近B e t n e r ( 1 4) 提出采用1 - 氨基金刚 烷（ A D A M） 与过量F M O C 试 剂反应， 生成衍生物可在全部氨基酸衍生物之后出峰， 这就排除了试剂峰的干扰。
该技术的应用， 无疑使该法衍生步骤简化， 且易于实现 自 动化三、 异硫氢酸苯酯( P I T C )作为E d m a n () 试 剂 P I T C最初广泛用于多肽及 蛋白质序列分析， 1 9 8 2 年K o o p [ 16 ] 提出用P IT C ( E d - m a n 试剂) 分析氨基酸， H e in r i k o n [ ] 和B id lin g m e y - e r [ 18 ] 完善了 方法的 衍生 步骤， 反应如下：P I T C 作为柱前衍生试剂， 它可以 和一、 二级氨基酸反应， 在室温下仅十分钟即可完成， 反应产物在 原来氨基酸结构上引入苯环产生紫外吸收， 使得能 够用紫外检测器( 2 5 4 n m ) 检测一 般说来， P I T C - 氨基酸结构稳定， 在室温下放置数小时、 冰箱中放置数 周后分析， 都可得到良好的结果 图4 是采用P I T C衍生法分析蛋白水解液色谱图P I T C 柱前衍生反 相H P L C法有很好的 分辨率和较短的分析时间， 但最初的一些报道指出P I T C方法的 再现性低于茚三酮法， 如果样品存在非挥发性盐类和洗涤剂， 都会使结果受到影响( 9 ， 尤其对天门 冬氨酸、 谷氨酸、 组氨酸和赖氨酸影响最大。
但最近几年研究已经证明 P I T C方法准确性可以和I C E法相媲美 现今P I T C衍生法已广泛应用于生 物 材料 、 饲料 及 食品 分析 中 (20 , 21 ) P I T C法分析蛋白 水解液中氨基酸的变异系数一 般为2 -4 ， 生 理体液为3 -5 % 但组氨酸和胱氨酸稍大， 分别为6 % 和1 0 % 表1 给出P I T C法与 值及I C E 方法的结 果比 较 但是该方法也具有三个劣势： 1 . 氨基酸衍生时 需要真空干燥以除去过量试剂， 使得P IT C法很难实现操作全部自动化； 2 . P I T C - 氨基酸不具有荧光， 不能给出高的灵敏度， 检测极限为5 0 p m o l ， 仅为 O P A法和 F M O C法的1 / 5 03 . 值得注意的是使用 P IT C易于降低柱寿命， Fr s t 等人提出在有保护柱 情况下， 一 根色谱柱可令人满意地分析8 0 0 F MO C 、 7 0 0 O P A和5 0 0 D a n s y l- C l ， 而尽管在严格的真空净 化和样品制备条件下， 最多只能分析1 5 0 个P IT C样 品， 这可能是由于存在痕量的 P I T C衍生剂造成的。
四、 丹酰氯（ 二甲氨基萘磺酰氯D a n s y l - C l ）D a n s y l- C l 原是检测一、 二 级氨基酸的著名荧光 剂， 生成氨基酸衍生物可用反相液相色谱 分离 ( 2 2 ,2 3) 衍生是按照T a p u h i (2 4 ) 提出的方法进行的：A A - N H 2 +D a n s y l C l A A N H - D a n s y l - C l +H C l D a n s y l- C l 衍生方法比 较简单， 尽管一些报道说 衍生物产率决定于 D a n s y l- C l 与氨基酸比例， 但经 T a p u h i 等改变一些条件后， 解决了这一问题， 最适 合的比 例一般为5 : 1 -1 0 : 1 D a n s y l- C l 与氨基酸反应时间比 较重要， 在室温 及避光条件下需3 5 分钟左右 反应产物转化率与反 应时间关系很大， 而且温度升高可以 加速产物转化， 但最高不可超过6 0 ， 否则D a n s y l- C l 会发生水解， 反而使产物转化率降低 图5 为D a n s y l- C l 法测定氨 基酸的标准色谱图。
表1 给出了D a n s y l- C l 法测定结 果与离子色谱法比 较D a n s y l - C l 法检测极限与 O P A和 F MO C法相 当， 线性范围一般在 1 5 -1 5 0 m o l ， 相关 系数为0 . 9 9 3 ， 回收率为9 5 -1 0 5 %， 平均为9 7 . 6 5 . 1 ％ D a n s y l - C l 分析氨基酸的优点是： 1 . 衍生物比 较 稳定， 一般可放置1 2 -2 4 小时； 2 . D a n s y l- C l 胱氨酸 衍生物线 性关系好， 它是目 前上述四种柱前衍生法中唯一可以定量测定生理体液中胱氨酸的方法 但 D a n s y l - C l 法也有许多 不足： 1 . 反应时间必须严格掌 握； 2 . 衍生产物对紫外光照比 较敏感， 故反 应要在避 光条件下进行， 特别是蛋氨 酸衍生物对光相当敏感， 回收率往往很低； 3 . 易生成多 级衍生物， 如赖氨酸、 组氮酸、 酪氨酸和胱氨酸均生成二级衍生物 综上所述， 以 上四种柱前衍生定量测定氨基酸的方 椒 法， 各有其独到之处 分析蛋白水解液四种方法 大约都需2 0 分钟， 检测极限： O P A F M O C D a n s y l- C l P I T C ， 衍生物稳定性： P I T C F MO C 綝D a n s y l - C l O P A ， 衍生所耗时间： F M O C P I T C D a n s y l-C l O P A。
从仪器设备上讲， 均采用两元梯度淋洗， 需要两 台高压液相色谱泵， 紫外或荧光检测器等 分析柱多 采用反相C 18 柱，F M O C法以 反相C 8 柱居多 从仪器 生产厂家看， 惠普公司和吉尔森公司采用 O P A与 F M O C结合法(2 5) ， W a t e r s 公司则建议采用 P I T C 法， 并推出了 专用的氨基酸 分析柱P ic o - T a g 及衍生 工作站， L K B 公司则认为 O P A F M O C和 P I T C 三 法 均可 使用 在实际应用中， O P A和F MO C在生理 体液中应用较多， 而在食品和饲料工业中P I T C法 占主导地位 据Fr s t。