《b7-h1及其受体pd-1分子在原发性肝癌组织中的表达及 临》由会员分享，可在线阅读，更多相关《b7-h1及其受体pd-1分子在原发性肝癌组织中的表达及 临（4页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、 世界华人消化杂志 2008年9月28日; 16(27): 3110-3113 ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R临床经验 CLINICAL PRACTICEB7-H1及其受体PD-1分子在原发性肝癌组织中的表达及 临床意义申民强, 孙趁意, 刘占举申民强, 孙趁意, 刘占举, 郑州大学第二附属医院消化内科 河南省郑州市 450014 申民强, 中国人民解放军152医院消化内科 河南省平顶山市 467000 教 育 部 新 世 纪 优 秀 人 才 支 持 计 划 资 助 项 目 , N o . NECT-05-0609 2005年河南省卫生厅科技攻关资助项目, No. 20
2、05-45 作者贡献分布: 此课题设计指导由刘占举完成; 实验操作由申民 强与孙趁意完成;研究所用试剂由刘占举提供; 本论文写作由申 民强, 孙趁意及刘占举完成. 通讯作者: 刘占举, 450014, 河南省郑州市经八路2号, 郑州大学 第二附属医院消化内科. 电话: 0371-63939084 收稿日期: 2008-08-07 修回日期: 2008-09-05 接受日期: 2008-09-08 在线出版日期: 2008-09-28Expression and clinical significance of B7-H1 and PD-1 in primary hepatocellular
3、carcinoma tissues Min-Qiang Shen, Chen-Yi Sun, Zhan-Ju Liu Min-Qiang Shen, Chen-Yi Sun, Zhan-Ju Liu, Depart- ment of Gastroenterology, the Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450014, Henan Prov- ince, China Min-Qiang Shen, Department of Gastroenterologey, the 152th Hospital
4、 of Chinese PLA, Pingdingshan 467000, Henan Province, China Supported by: the New Century Talent supporting Scheme Projects of the Ministry of Education, No. NECT-05-0609; and the Health Department Scientific and Technological Projects 2005 in Henan Province, No. 2005-45 Correspondence to: Zhan-Ju L
5、iu, Department of Gastro- enterology, the Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450014, Henan Province, China. Received: 2008-08-07 Revised: 2008-09-05 Accepted: 2008-09-08 Published online: 2008-09-28Abstract AIM: To analyze expression of B7-H1 and PD-1 in primary hepatocel
6、luar carcinoma (HCC) tissues and to investigate its role in HCC carcinogenesis.METHODS: B7-H1 protein expression in HCC and normal liver tissues was determined using immunohistochemistry assay and real-time PCR (RT-PCR) in 42 patients. PD-1 expression in in- trahepatic lymphocytes was detected using
7、 flow cytometry. The relationship between B7-H1 and the Edmondson grading and tumor metastasis of HCC were analyzed subsequently.RESULTS: The B7-H1 protein and mRNA lev- els were significantly increased in HCC tissues compared with normal liver tissues (85.71% vs 28.57%, 7.14%; 0.73 0.21 vs 0.35 0.1
8、2, 0.23 0.07, all P 80%. 结果判断: 10%为阴性; 10%-100%为阳性.1.2.2 RT-PCR: 将标本(50-80 mg)放在装有液氮的研钵中充分研磨, 按照TRIzol试剂说明书逐步加入氯仿、异丙醇、乙醇等提取RNA, 并测定RNA浓度、纯度和完整性. 以提取的总RNA为相关报道 国内外有学者曾 经发现B7-H1分 子在胃癌、结肠 癌、肾癌等组织 内表达升高, 并诱 导肿瘤组织内T细 胞免疫耐受, 促使 肿瘤生长, 但缺乏 在肝癌中的研究3112 ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R 世界华人消化杂志 2008年9月28日 第16卷 第27
9、期模板, 按RevertAidTM First Strand cDNA Sythesis kit反转录试剂盒说明书进行操作. 反转录步骤如下: 总RNA 5 mL, Oligo-(dT)Primer 1 mL, 无RNase水6 mL, 混匀, 离心. 70, 5 min; 立即置于冰浴, 2 min. 加入5Buffer 4 mL, RNase抑制剂1 mL, dNTP 2 mL, 混匀, 37 5 min; 加入反转录酶1 mL, 42 60 min; 70 10 min; 立即置于冰浴, 合成cDNA第1链. 以cDNA为模板进行PCR扩增, PCR扩增反应步骤如下: 反应体积为25 m
10、L, 94预变性5 min; 94变性30 s, 61褪火30 s, 72延伸60 s, 共35循环. PCR产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳(溴化乙锭染色)后, 紫外透射反射仪下观察结果, 并在凝胶成像仪上照相, 扫描所得灰度值进行统计学分析4-6.1.2.3 肝脏组织内淋巴细胞分离: 肝组织内淋巴细胞分离方法见参照我们既往报道7. 简述为, 组织标本放于含有抗生素的PBS液冲洗, 去除表面的红细胞, 然后将标本转至37含有胶原酶A(1 g/L)和DNA酶(5 mg/L)的消化液中消化3-4 h, 然后通过Percoll淋巴细胞分离液离心(600 g 20 min), 取得肝组织内单个核淋巴
11、细胞, 用于流式细胞仪分析. 1.2.4 流式细胞仪检测: 将上述分离得到的肝组织内淋巴细胞配制成1109/L浓度, 取样本100 mL, 用含有2 g/L胎牛血清白蛋白和1 g/L NaN3的PBS洗2次. 然后用含有合适浓度的荧光素抗体(如PE-PD-1、FITC-CD3、同型Ig对照抗体), 于4染色, 30 min后, 用PBS洗2次去除未结合的抗体, 用30 g/L多聚甲醛溶液固定, 最后用流式细胞仪(FACSort, 美国BD公司)分析, CellQuest软件分析, 计算PD-1阳性T细胞数5.统计学处理 B7-H1表达水平以meanSD表示, 采用SPSS13.0统计分析软包分
12、析, 根据资料类型采用ANOVA、t检验、2检验, 取P0.05为差异有统计学意义.2 结果2.1 肝组织中B7-H1分子原位表达 B7-H1染色在肝癌组织中均表达增强(+以上), 主要在癌细胞膜和胞质内, 呈棕黄至棕褐色颗粒或团块, 多区域分布, B7-H1表达阳性率为85.71%(36/42); 而癌旁组织阳性表达率为28.57%(12/42), 肝炎组织或正常组织仅微弱表达, 阳性率为7.14%(3/42)仅有少量表达. 统计学分析发现, HCC组织中B7-H1阳性表达率明显高于癌旁组织和正常组织(P0.05). 进一步分析发现(表1), B7-H1染色强弱与细胞分化程度相关, 癌细胞分
13、化程度相对较高, 侵袭能力较低, B7-H1染色较弱; 癌细胞异型性明显, 分化程度较低, B7-H1染色强, 并与肿瘤的侵袭性生长相一致.2.2 肝组织中B7-H1 mRNA表达 HCC组织中B7-H1 mRNA条带明显增亮, 应用灰度扫描半定量分析, B7-H1 mRNA在HCC组织、癌旁组织和正常组织中阳性表达灰度值分别为0.730.21、0.350.12和0.230.07, 统计学分析发现, B7-H1 mRNA在HCC组织的表达水平明显高于癌旁组织(P = 0.041)和正常组织(P = 0.015); 而癌旁组织和正常组织间B7-H1 mRNA表达, 差异无显著性(P = 0.92
14、31, 图1).2.3 B7-H1表达与临床资料的相关性分析 B7-H1阳性表达与HCC的病理分级和有无侵袭转移相关(2 = 7.876, 8.492, 均P0.05, 表1); 但与患者性别、年龄、肿瘤大小、肿块类型、AFP水平无关.2.4 PD-1分子在HCC组织内T细胞表面表达 使用肝组织标本, 分离肝组织内淋巴细胞, 通过流式细胞仪分析发现, PD-1+CD3+ T细胞数在HCC组织内明显高于癌旁组织(20.15%3.47% vs 2.67%0.53%, P0.001), 提示在癌变组织内T细胞表达B7-H1的配体明显升高, 可能参与癌变组织的免疫调节作用.表 1 B7-H1与HCC转
15、移和病理分级的关系分组 n B7-H1阳性 n(%) 2 P癌灶转移 有 27 20(74.07) 7.876 0.05无 15 15(100.00)病理分级 - 19 14(73.68) 8.492 0.05III- 23 21(91.30)图 1 RT-PCR分析B7-H1表达. M: 100 bp的DNA标准参照; 1: 健康组织; 2: 癌旁组织; 3: HCC组织.M 1 2 3600 bp 500 bp 400 bpB7-H1 -actin创新盘点 本文运用免疫组 织化学、RT-PCR 和流式细胞仪方 法探讨B7-H1在 肝癌组织中表达, 结果表明B7-H1 在肝癌组织中表 达升高, 与癌细胞 分化程度、病理 分级和有无侵袭 转移有密切关系.应用要点 通过检测B7-H1, 可早期诊断肝癌, 判断肝癌的侵袭 转移能力和预后申民强, 等. B7-H1及其受体PD-1分子在原发性肝癌组织中的表达及临床意义 3
