逍遥散对慢性温和不可预知应激模型大鼠的影响

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1、http:/ -1- 逍遥散对慢性温和不可预知应激模型大鼠的影响逍遥散对慢性温和不可预知应激模型大鼠的影响1 熊静悦，曾南，张崇燕，杨婧，刘小帅 成都中医药大学药理教研室，四川成都（610075） E-：mailZ 摘摘 要：目的：要：目的：观察逍遥散对慢性温和不可预知应激（CUMS）模型大鼠行为学及脑内单胺 类神经递质含量的影响。方法：方法：应用慢性温和不可预知应激程序对大鼠进行为期 11 周的造 模，造模后 3 周，分别采用逍遥散（19.5gkg-1、25.0gkg-1）和丙咪嗪（10mgkg-1）对模型 大鼠进行为期 8 周的治疗。实验进程中，定期测定大鼠体重、糖水消耗量；应用开场实验测

2、 定大鼠爬行格子数和站立次数； 造模、 治疗结束后处死大鼠， 解剖分离大鼠皮层和海马部位， 采用荧光分光光度法测定 5-HIAA、5-HT、DA 和 NE 含量。结果：结果：与正常对照组比较，大 鼠造模后 3 周糖水消耗量、爬行格子数和站立次数均明显减少（p0.05）;逍遥散 25.0gkg-1连续给药 8 周,能明显提高 模型大鼠皮层部位 5-HT 含量及海马部位 5-HIAA 含量（p0.05，p0.01） 。结论：结论：逍遥散对 CUMS 抑郁模型大鼠表现出抗抑郁作用，作用机制与影响脑内单胺类神经递质 5-HT 活性有 关。 关键词：关键词：逍遥散；慢性温和不可预知应激（CUMS） ；抗

3、抑郁 逍遥散出自宋朝太平惠民和剂局方 ，是中医调和肝脾的代表方剂之一，具有疏肝解郁、养血健脾之功效，用于治疗肝郁血虚脾弱证。作为调节情志的经典名方，现代临床中逍遥散被广泛用于精神科疾病的治疗，其中在抑郁症的治疗中应用较多，能使患者情志舒畅、心情愉快、 精神状态得以改善， 疗效明确， 但治疗机制至今尚未完全阐明。 实验研究发现1-3，逍遥散（10.0gkg-1和 20.0gkg-1）连续给药 6 天，每日 2 次，能明显升高正常大鼠下丘脑去甲肾上腺素(NE)和纹状体多巴胺(DA)含量； 连续 4 周采用“颈部带枷单笼喂养法”造成大鼠肝郁证模型，逍遥散水煎剂连续治疗 2 周后，能降低模型大鼠大脑、

4、间脑和脑干部位中 5-羟色胺(5-HT)与 DA 含量，升高 NE 含量；对“慢性束缚应激法”所致肝郁证模型大鼠，造模 1周后用逍遥散（19.2gkg-1）治疗 4 周，能显著提高模型大鼠脑组织中 NE 和 DA 水平。研究结果提示逍遥散对中枢神经系统 5-HT、 NE 及 DA 能神经递质的影响作用， 可能是其发挥“疏肝解郁”功效的药理学基础之一。 由于抑郁症的形成是致病因素长期作用的结果， 因此在抑郁动物模型的制备时， 必须考虑长期、多致病因素的叠加作用。慢性温和不可预知应激模型(Chronic Unpredictable Mild Stress, CUMS)的制备，是采用随机组合的多种不

5、同应激因子（如冰水游泳、噪音刺激、异物刺激等） 对动物长期刺激而进行造模。 该模型能较好地模拟人类抑郁的核心症状快感缺失4,5（以糖水消耗量反映） ，同时模拟了抑郁患者运动能力、社交能力、探索行为能力下降等症状表现，也能造成脑内单胺类神经递质(5-HT、NE 和 DA)含量的改变6,7，其理论依据与人类抑郁症中慢性、低水平的应激源促进疾病发生、加速疾病发展的机制更接近，是目前较为推崇、使用广泛的抑郁动物模型7-13。本研究采用 CUMS 程序复制大鼠抑郁模型，观察逍遥散对该模型大鼠体重、活动量、糖水消耗量及脑内单胺类神经递质水平的影响，以期为逍遥散“疏肝解郁”之功效及临床治疗抑郁症的应用提供药

6、理学依据。 1本课题得到成都中医药大学校基金重点项目（ZRZD200503）的资助。 http:/ -2- 1. 材料与方法材料与方法 1.1 动物动物 SD 大鼠，清洁级，初始体重 190-220g，四川省医学科学院实验动物研究所提供。合格证号：scxk（川）2004-16。 1.2 药物药物 逍遥散(Xiaoyao San, XYS)：柴胡 9g，当归 9g，白芍 9g，白术 9g，茯苓 9g，薄荷 4.5g，生姜 4.5g，甘草 4.5g。药材购于成都中医药大学附属医院。以浸膏量为评判指标，采用 33因素正交表，综合考察加水量、煎煮时间和煎煮次数三者的影响作用，经 DPSv3.01 软件

7、统计分析后，确定逍遥散水煎剂的制备工艺如下：药材加 4 倍量水，煮沸后煎煮 20min，同法煎煮三次，合并三次滤液，浓缩成 1.25gml-1的药液，4冰箱保存。此外，取适量浓缩液、柴胡标准药材（四川省药品监督管理所，批号 120992200504）及配方中柴胡药材的甲醛溶液 （参照 2005 版药典第 198 页所记载的方法处理） ， 在同一硅胶 G 薄层板上点样， 于 365nm紫外灯下检查， 三者均在薄层板上的相同位置显示相同颜色的柴胡总皂苷荧光斑点， 表明复方所用柴胡符合药典规定，且水煎剂中柴胡可被检出。 丙咪嗪 (Imipramine, IMI)：Sigma，批号 I0899。生理盐

8、水配制成 1mgml-1溶液，临用前配制。 1.3 开场实验开场实验 参照Chen CZ 13方法，将大鼠放入自制开场实验箱的中心位置（100cm100cm木箱，底部等分为100个10cm10cm小格），适应2min后，观察随后4min内大鼠的爬格子数（以大鼠的四肢均进入一个格子为一格） 和站立次数 （以大鼠的两前肢离开地面， 身体直立为一次） 。开场实验分别在大鼠分组前、造模3周及10周后进行，共3次。 1.4 糖水消耗实验糖水消耗实验 参照 Stathis 方法7，开始造模前一周里对大鼠进行 2 次 1%蔗糖水偏好训练（每个鼠笼放置已定量的 2 个喂水瓶，1 瓶纯水，1 瓶 1%蔗糖水，喂

9、水 1h 后撤除）。于 CUMS 程序开始前进行第一次糖水消耗量(Sucrose Consumption，SC)测试。糖水偏好训练和测试均于大鼠禁食禁水 23h 后进行 1.5 慢性温和不可预知应激模型的建立慢性温和不可预知应激模型的建立 参照Stathis方法7略作改变。刺激因子包括电刺激噪音、冰水（4）游泳、禁食、鼠笼（45o）倾斜、潮湿垫料、禁水、合笼、禁食禁水、异物放置、异味刺激，具体执行安排见下表。共执行11周。 http:/ -3- 表1 慢性温和不可预知应激模型建立中各种刺激因子的安排 周一 10:00-12:00：4C 冰水游泳 10min/只；15:00-次日 14:00：所

10、有大鼠禁食禁水；17:00-次日 10:00：潮湿垫料（将 200ml 水加到有垫料的笼底） 。 周二 10:00：各组称重；14:00-15:00：1%糖水消耗测定；17:00-次日 9:00：禁水。 周三 10:00-17:00：0.1mA 电刺激10dB 噪音/1min/次，间隔 30s 后进行第 2 次，如此循环 10 次；17:00-次日 10:00：异物放置。 周四 10:00-17：00：鼠笼倾斜；17:00-次日 10:00：合笼（2 只/笼，对象固定） 。 周五 10:00：恢复单笼饲养；12:00-次日 8:00：禁食；14:00-16:00：4C 冰水游泳 10min/只

11、；17:00-次日 10:00：异味刺激（氨水或冰醋酸） 。 周六 10:00-次日 12:00：禁水禁食；17:00-次日 12:00：潮湿垫料。 周日 10:00-17:00：0.1mA 电刺激10dB 噪音；17:00-次日 10:00：鼠笼倾斜。 1.6 实验分组与给药方式实验分组与给药方式 大鼠适应性饲养 1 周，5 只/笼。1 周后根据体重和开场实验结果随机分为正常对照组和模型组，正常对照组的大鼠 5 只/笼，模型组的大鼠均单笼饲养。模型组大鼠造模 3 周后，按体重和开场实验结果随机分为模型对照组、模型+逍遥散高、低剂量组、模型+丙咪嗪组，动物仍保持单笼饲养，正常对照组动物饲养方式

12、不变。造模第 4 周开始，模型对照组每日灌胃蒸馏水，模型+逍遥散高、低剂量组每日灌胃逍遥散水煎剂（剂量分别为 25gkg-1、19.5gkg-1），给药体积 2ml100g-1。模型+丙咪嗪组每日腹腔注丙咪嗪 15mgkg-1，给药体积1ml100g-1。各组动物连续给药 8 周。 1.7 大鼠皮层与海马部位单胺类神经递质的测定大鼠皮层与海马部位单胺类神经递质的测定 各组大鼠末次给药 30min 后处死， 在冰台上迅速分离大脑皮质和海马部位， 称重后于干冰中快速冷冻， 置-70保存待测。 大鼠大脑皮层和海马部位 5-羟吲哚乙酸 （5-HIAA） 、 5-HT、NE 及 DA 含量测定采用荧光分

13、光光度法测定（RF-5301 型荧光分光光度仪，日本岛津） 。 1.8 统计学处理统计学处理 数据以Xs表示，各组数据呈正态分布时采用SPSS11.5统计软件进行One-Way ANOVA分析，非正态分布采用DPSv3.01统计软件进行K-W检验。 2. 结果结果 2.1 CUMS 程序实施前及实施后程序实施前及实施后 1、3 周对大鼠开场实验和糖水消耗量的影响周对大鼠开场实验和糖水消耗量的影响 见表2。CUMS程序实施前正常对照组与模型组大鼠的体重、爬行格子数和站立次数均无明显差异， 但模型组大鼠的糖水消耗量显著减少， 提示单笼饲养对动物奖赏反应性的抑制。CUMS程序实施1周后，与正常对照组

14、比较，模型组大鼠的体重无显著差异，糖水消耗量仍表现出明显的下降。CUMS程序实施3周后，与正常对照组比较，模型组大鼠的爬行格子数、站立次数和糖水消耗量均显著减少，但体重无明显差异，提示CUMS程序的应用已引起动物快感缺乏、运动能力和探索能力下降。 http:/ -4- Tab2 Effects of CUMS on open-field test, weight and sucrose consumption in rats Before CUMS One week after CUMS Three weeks after CUMS Normal (n=10) Model (n=40) Nor

15、mal (n=10) Model (n=40) Normal (n=10) Model (n=38) Wei ght (g) 196.0024.93 211.307.64 214.0026.23 237.408.22 250.5027.87 257.47. 10 Cros sing s 65.3015.20 65.357.50 - - 90.9020.41 31.367. 01* Stan ding s 7.703.05 5.651.08 - - 10.301.87 4.460.9 5* SC( ml) 28.507.50 8.580.61* 34.005.00 10.080.81* 53.7

16、516.25 9.820.6 6* Open-field test included numbers of crossing and standing. Crossings indicated spontaneous activities of rats while standings showed curiosity of rats. Sucrose consumption test was carried out 23h after food and water deprivation. SC was the taken volume of sucrose solution which represented rats r