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1、?国外医学临床生物化学与检验学分册该综述 审校彩祀广货陈蛋白质的镇标记技术第二军医大学三六九研 究室摘要?蛋白质的? ? 十标 记是?一? ?法的关健技 术之一。本文综合论述了蟹 合剂及其用量、抗原和杭体的标 记方法、标记率的计算、标记 物的使用和 保存等问题。八十年代初期发展起来的 时间分辨荧光免疫分析? ?一? ?法?一剐,其特 异性、测量范围、检测 速度和标记物的稳定性均 优于其 他非放射性免疫分析法,国内外许多作者已系统论述了其原理、特点、成就 和发展前景?一“?。制备符合要求的?“十标记物 是该法的关键技术之 一。基于? ? ? ?公司创立的解离增 强翎系荧光 免疫分析? ? ?系统
2、较加拿大推出的? ? ? ?固相分析系统成熟,目前已有近? ? 种试 剂盒 和?种型号的 测量仪器投放市场,国内大多数学者也仅开展此项研究和应用,因而本文着重论述? ?系统的? ?十标 记技术、方 法和实 际工作中应注意的有关 问题。?“盆合荆?一? ?法的 示 踪剂不是荧光素,而是稀土 元素?、?、?等金 属离子【“?。它们不能直接与蛋白质联接,需要一个具有双功能基 团、溶解度好和稳定性高的鳌合剂起联 接作用,一端鳌合?十,一端同蛋 白质的氨基结合。常用鳌合剂有?异硫氰酸苯基一?一。?、异硫氰酸苯基一? ?【 。一 ?、重氮苯基一? ?、二乙三胺五乙酸? ? ? ?及其环醉? ?、氨基苯基一
3、四氮杂环十二烷四乙酸?】、氨基苯基一?和? ?等。它们鳌合?能力很强,鳌合效率高且非常稳定。但在低? ?条件下,?又可以完全从配体上解离下来,为下一步被另一种鳌合剂鳌合创造了条件。从理论上讲,一个鳌合剂分子只能赘合一个? ?十,而一个蛋白质分子 却可以结合几个乃 至几十个鳌合剂分子。因此,实际应用时,赘合剂?十?或?即 可,鳌合剂?一?与蛋 白质分子比,要大于?“? ?一 至二个数量 级,即数十倍至 数百 倍?见表?,使其充分过 量,游离部分用柱层析或透析法去除。、?表?部分蛋白质?干标记所用彗合剂量鳌合剂蛋白质倍数文献?异硫氰酸苯基一?异硫氰酸苯基一?、重氮苯基一? ?抗?抗?抗?兔抗地高
4、辛?抗? ?羊抗兔? ? ? ? ? ? ?年第?卷第?期?丫标记方法同其 它 免疫分析技术一样,标 记物的质量直接 影 响? ?一? ?法的建立。因此在整个标记过程中,应严格控制反应条件和时 间,保证抗原或抗体的免疫活性没有较大损失。对于 抗体,标记方法分为鳌合剂先鳌合?卜再联接蛋白质和先 联接 蛋白再赘合?十两 种,国内有人【“? ?称其为一步法和二步法。而全抗原与 抗体的标记 方法相 同,半抗原则需要预先加以修饰,再按 上述方法进行。标记反应基本原理如下?一二、?,哎,?蛋反?刊夕叹?产“一、?一一一人、? 专 妞?一、,一乞一。砂、匡选址,一?一洲毛喝沙酬常用标记方法有?一、先鳌合?“
5、?标记抗体法鳌合剂在较高?条件下鳌合? ?十很容易。因此 按一定比例将? ?加 至鳌合剂 溶液中,摇匀,反应后 即得 鳌合剂一? ?。? ?等 ?采用此法标记了抗 胎 儿血 红蛋白? ? ?,? ? ?取? ? ?碳酸钠缓冲液?配制的抗? ?,加入 异硫氰酸苯基一?一? ?,使其同? ?克分子比成 为? ? ?,混匀,室温过夜。加入? ? ?贝?一? ?柱?,? ?书?洗脱,合并峰管,测量? ?浓度,计算标记率,每?加人?,一?保存备用。二、后鳌合?砂?标记抗体法例如,?等? ?取?,加 至纯化的抗黄曲霉毒素? ? ? ? ! 抗体液中,混合? ?,调节?至?,室 温反应? ?移 入透析袋,勃
6、? ? ?柠檬酸盐缓冲液? ?透析,以去除游离? ?,取 出,加至 柠檬酸盐缓冲液配制 的? ?溶浓中,室温反应?,加入?一?柱?,? ?磷酸 缓冲液? ?洗 J U色,流速为In、/min;2 8Onm检 测 吸光度,合 并峰管, i贝!1定Eu名 +浓 度后,分装,一2 0保存一可用4个) : J。三、先鳌合Eu“十标记全 抗原 法以标记 肌红 蛋 白 (Myoglobin, Mb)为例 41。取100协 g(15 0件l)10 0 mmol/L碳酸钠缓冲液配制的Mb液,加 入200件g(10 0“I)异硫氰酸苯基一DTT A一Eu3+,室温过夜,以SePharo se6B和SePhade
7、xG一2 5混合柱(1x30 cm)层析分离,用含有0.9肠NaC I、0.05呱NaNs的50m mol/LTri。一HCI( P H7. 7 5)洗脱。每管 收集lm l,其 它方 法 同上。四、先鳌合Eu“+标记半抗原法Bamar d等l7用 此 法标记 了雌酮一3(Es tr one 一3)。其 方 法是将雌 酮一3一葡糖普酸联接上B SA,制 成E一3一G一BSA,而后再用鳌合剂一Wll74卜Eu3干)标记。综上所述,采用先鳌合Eu3十法较后鳌合 Eu a+法简便,且标记时间缩短,因而可提高标记蛋白回收率和减少其免疫活性丧失。此外,鳌合剂同蛋 白结合,温度和反应液pH等是影 响 因素
8、之一。许多作者 建议用4过夜或室温 过夜,反 应液 用5 0m m o l/L碳酸钠 缓冲液(P HS.59.8),若pH过高,则可导致蛋白变性。同时,反应液中应杜绝含有胺类物质和叠氮钠【2月。洗脱液较多采 用 含有0.9肠NaC I和0.05肠NaN3的Tris一HCI缓冲浓 (pH7.8),层 析分离以柱层析最为常用,也可根据实际情况,使用透析法,以去除游离鳌合剂和/或Eu“+。标记率标记 率,即每个蛋白质分子 上 结合的Eu s+数。根 据以下 公 式“计算:Eu3干(协mol/L ) =标记物Eu a+计数x稀释倍数 l000 X I灿o 1/ LEu3十计数蛋白(mg/m l)=A
9、bs(250)一o.o osxEu3+(脚01/L)34 (lmg/ m1IgG吸光度)国外医学临床生物化学与检验学分册蛋白(“mo l声)蛋白(mg/m l)Xl00000o 而而而百兀两勇芬系勤了标记率(Eu3+/IgG )=Eu3+(协咖l/L)蛋白(卜m ol声)回收率(肠)=loox蛋 白(mg/ml)x合并管量(m l) 所加蛋白(mg)标记率的大小,同所用pH、温度、反应时间和鳌合剂 种类与 纯度有 关。如pHg.8,室温反应2一3天,或3 7反应 数小 时,即可获得较高标记率的标记物,否则标记 率相对较小。同时,标记率也与被标记蛋白的氨基酸结构和等电点有关I“ 2,例如亲合素(
10、Av i d in )等电点高,标记率为8 1 5,而链 霉 亲合素(Streplavidin)等电点则相对较低,故标记率只有4 1 0“, 。由此 可见,即便使用相 同鳌合剂和反应 条件,不 同蛋白的标记率也是不相同的(见表2 )。一 般情况下,除非标记率过高(如异硫氰酸苯基一DT TA标记 的大表2蛋白质异硫佩酸苯基一O T下A标记不同蛋白质的平均标记率标记率蛋白质标记率兔抗地高辛抗胰岛素抗SH B G抗h AFP抗hTS H 肌红蛋白碳酸配酶IIgGMCA bMCA bMCA bMCA b9。 07。 55。 07。 99。 58。 29。 4抗C E AMcA b抗h FS HMeA
11、b牛y球蛋白亲合素链霉亲合素兔抗hL P (a) IgG抗h LHMeA b12。 613。 314。 99。14。 721。 014。 5劝冲于2 0Eu a+/I gG) 或过低,影响标记物使用效果外,标记率在一个相 对恒 定的动态变化范围属于 正 常现象,它并非是 衡量标记物能否使用 的 唯一标志,关键 要看实际免疫分析效果。但同一种蛋 白质采用不 同鳌合剂标记的表4.部分标记物免疫分析用t标记物用量(ng/孔)标记物用量(ng/孔)习、 口习lUC甘n甘nQnn U, 1 1勺亡曰 .二曰 . . 表3.同一蛋白质不同鳌合剂标记的平均标记率hTSHMeA b一Eu50hLHMeAb一E
12、u1 0 0hAFPMeAb一Eu75hCGMeAb一Eu4 0地高辛IgG一Eu1 0 0pL A:gG一Eu1黄曲霉毒素“G一E u 链霉亲合索一E uHbFMcAb一Eu严Lpa,I gG一Eu蛋白质异硫氰异硫氰重氮苯酸苯基酸苯基基一E D I人一D T TA一E D I,A表4为部分标记物 免疫分析实验 时的用 量。二1 0 . 07 . 9 9 . 5一抗bA FPMcA b抗h T SHMeA b抗h LHMeA b7。 010。 010。 0结果却基本一致(见表3)。.侧标记物的使用Eu“标记物 在实 际免疫分析中的用量,同标记率本身无关,主要 根据 抗原或抗体的纯度、亲合力和所
13、需要的 信号水平而 定。通常10IO0ng/孔(SOn吕50 0ng /m l)已足够,标记物的保存Eu“十标记物很稳定,一2 0或4储 存均 达6个月左右。存放前,用含有。.9呱Nac l、0.00日肠NaN3、 0.5肠B SA、0.01呱Tween40和20林m o l/LDT PA的分析缓冲液或磷酸缓冲液稀释配制,如果标记蛋白浓度在50卜 g/ml以上,可 不加载体蛋 白BSA。此外,载体蛋白不能使用 牛球蛋 白或其 它蛋 白质,以免 造成 重金 属离子 污染。在 存放期 间,如发现实验本底信号有增高倾向,表明蛋 白有聚积,可用o.Zom滤膜过滤 “1。年第14卷第6期249丫连接酶链
14、反应(L CR)一一种D N A扩增和诊断的新技术北京医科大学生物 化学教研室刘海英贾弘提综述董苍玉审校提要连接酶 链反应 (LCR) 是在连接酶扩增反应中,引入热 稳定的D N A连接 酶而建立的、类似P C R技术的新方 法。 LCR既可扩 增、又可鉴 定单个碱基突变。因此,与PCR技术 一 寸样,LCR可用 于D N A扩 增和已知 基 因突 变类型 的遗传病诊断与普查。DNA诊断学,即利用分子生 物 学技术和方 法在D N A水 平分析、鉴定遗传病所涉及墓因的置 换、缺失或插 入等突变。目前,结语制备符合要求的Eu a+标记 物,是T R-FIA法的关键技术 之一。只 要拥有溶解度好、
15、性质稳定和纯度高的鳌合剂,标记并不 困难。但目前市场上除DT PA外,均无商品供应。我室经 过几年的研究,先后合成了 异硫氰酸苯基一EDTA等三种鳌合剂,并已成 功地应用于免疫分 析 实验。,从而为T R一 P IA法 的进 一步研究提 供了物质 基础。蛋 白质的Eu a标记 技术,同 制备经典的R IA法标记物 相比,具有操作简便,标 记 物稳定,试 剂货架寿命长和无放射性危害等优点。因此,问世十年来已受到广泛重视。参考文献 1.贺广彩,等:国外医学临床生物化学与检验学分册.2992,2 3(5):2522.E letthe rio sP,etal: AnalChe爪。 2990;62:11493.MortonRC,。tal:AnalChem.r 9 9 0;62:1 8 4 14。Lovgro nT,。tal:Tala nta。 1954,3
