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1、葛根素对前脂肪细胞分化的影响硕士研究生： 指导教师： 指导小组：专业名称：摘冯雅静 范晓磊教授 黄敏教授 张卓然教授 病原生物学要目的：肥胖在胰岛素抵抗、2 型糖尿病的发病中起关键作用，抑制食欲、增加能量消耗有利于2 型糖尿病的防治。脂质代谢紊乱和胰岛素抵抗为2 型糖尿病患者的主要特征，也是糖尿病患者易合并心、脑血管病的主要原因。在临床治疗糖尿病时，由于胰岛素在脂肪细胞分化及糖脂代谢中的作用，临床使用胰岛素及促胰岛素分泌剂磺酰脲类药物患者出现体重增加；胰岛素增敏剂噻唑皖二酮( T h i a z o l i d i n e d i o n e s ，T Z D s )类药物，通过激活P P A
2、 R 丫( P e r o x i s o m ep r o l i f e r a t o r s a c t i v a t e dr e c e p t o r sT ) 转录因子，增加胰岛素敏感性的同时，诱导脂肪细胞分化，增加患者体重。现已证实葛根素可以有效改善2 型糖尿病患者胰岛素的敏感性，在临床上主要作为糖尿病治疗的辅助治疗。葛根素是否对糖尿病患者体重变化有影响，目前尚不清楚，研究葛根素对糖尿病患者体重的影响情况，将为进一步阐明其治疗糖尿病的作用机制提供了依据。方法：将3 T 3 一L 1 前脂肪细胞以5 1 0 每孔的浓度接种于6 孔培养板，一天以后可以达到融合。用含1 0 胎牛
3、血清的D M E M 高糖培养液在3 7 ，5 C 0 ，培养，待细胞融合2 天后，加0 5 m m o l L 异丁基一甲基一黄嘌呤，0 2 5 g m l 地塞米松和l | I g m l 胰岛素的培养液再培养4 8 h ，随后以1 0 胎牛血清高糖D M E M 继续培养，4 0 p g m l 浓度的葛根素在诱导的第一天开始加入培养液，直到实验结束，分化l O 1 2 天的细胞用于实验：用O 1m g m l 油红O 染色2 小时，倒置显微镜下观察结果，拍摄图片。采用两步法半定量一逆转录聚合酶链反应( R e v e r s eT r a n s c r i p t i o nP o
4、l y m e r a s eC h a i nR e s p o n s e ，R T - P C R ) 检测P P A R 7 2 ( P e r o x i s o m ep r o l i f e r a t o r s a c t i v a t e dr e c e p t o r s2 ，P P A R y 2 ) m R N A 的表达水平。细胞分空白对照组和4 0 p g m l 葛根素组。以T r i z o l 提取诱导分化完全的总R N A ，用A M V 逆转录酶把总R N A 逆转录为e D N A 。以琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物，用F X M A C 进行扫描分
5、析。P P A R 7 2 的蛋白质免疫印迹分析，D A B 显色液显色，F X M A C 进行扫描分析结果。结果：一、前脂肪细胞诱导分化1O 天后，空白对照组细胞呈现典型的脂肪细胞表型，9 0 以上细胞中富含较大脂滴，而葛根素处理组，仅2 0 “ - - 3 0的细胞出现较大的脂滴，其油红0 的着色明显较空白组淡。二、M T T 结果显示，葛根素处理组浓度分别为lO 、2 0 、4 0 p g m l 时，M T T 检测O D 值分别为0 3 8 4 8 0 0 1 6 9 、0 4 1 0 5 0 0 2 0 1 、0 4 3 2 8 0 0 1 9 5 ，与空白对照组相比均为P O
6、0 5 ，差异有统计学意义；葛根素处理组浓度为8 0 、16 0 1 a g m l 时，O D 值为0 3 10 4 0 0 1 4 9 、0 3 2 0 1 0 0 15 3 ，与空白对照组相比差异无统计学意义。三、半定量R T - P C R 结果分析表明，3 T 3 一L 1 前脂肪细胞诱导分化过程中加入葛根素，其P P A R 7 2 m R N A 的表达量明显降低，空白对照组和葛 根素1O g m l 、4 0 I t g m l 处理组与内参照光密度积分值之比( p u e r a r i n l j a c t i n ) 分别为1 3 8 6 6 0 0 2 1 0 8 、
7、1 1 7 9 4 0 0 1 9 3 7 、0 7 7 6 5 0 0 1 8 7 7 ，4 0 p g m l 葛根素处理组与空白对照组相比P O 0 5 ，差异有统计学意义。四、蛋白质免疫印迹结果表明，葛根素处理的3 T 3 - L l 前脂肪细胞在分化过程中，其P P A R 7 2 蛋白质的表达量降低。结论：前脂肪细胞的增殖M T T 检测结果显示低浓度葛根素可促进前脂肪细胞的增殖。油红O 染色结果显示，葛根素处理组能抑制前脂肪细胞向脂肪细胞转化。半定量R T P C R 和蛋白质免疫印迹结果分析表明，葛根素抑制前脂肪细胞的分化，可能是由于降低其P P A R y 2 m R N A
8、 和蛋白的表达所致。关键词：葛根素脂肪细胞分化P P A R 7 2基因表达2E f f e c to fp u e r a r i no nt h ed i f f e r e n t i a t i o no f pr e a d l p O c y t eM a s t e rd e g r e ec a n d i d a t e ：F e n gY a ji n gS u p e r v i s o r ：P r o f e s s o rF a nX i a o l e iV i c e s u p e r v i s o r ：P r o f e s s o rH u a n g
9、m i n “P r o f e s s o rZ h a n gz h u o r a nM a jo r ：P a t h o g e n i cB i o l o g yA b s t r a c tO b j e c t i v e ：O b e s i t yp l a y sak e ya c t i o ni nt h ed i s e a s eo ft y p e2d i a b e t e sa n di n s u l i nr e s i s t a n c e I ti sb e n e f i c i a lf o rp r e v e n t i o na n d
10、c u r i n gt h et y p e2d i a b e t e sb yt h ew a yo fi n h i b i t i n ga p p e t i t ea sw e l la sp r o m o t i n ge n e r g yc o n s u m i n g T h ei n c r e a s eo fa d i p o c y t e si sa r o u s e df r o md i f f e r e n t i a t i n go ft h ep r e a d i p o c y t e s T h ev o l u m eo fa d i
11、 p o c y t e sr e f l e c t st h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nl i p i d o l y s i sa n dl i p i ds y n t h e s i s L i p i dm e t a b o l i cd i s o r d e ra n di 矗s u l i nr e s i s t a n c ea r et h ek e yf e a t u r e so ft y p e2d i a b e t e s ，w h i c ha l s ot h em a i nc a u s e so f
12、c a r d i a c v a s c u l a rd i s e a s e s A tt h ec l i n i c ，c u r i n go fd i a b e t e su s u a l l ye m e r g ew e i g h tg a i n E u g l y c e m i ca g e n ts u c ha sT h i a z o l i d i n e d i o n e s( T Z D s ) c a ni n c r e a s et h ei n s u l i ns e n s i t i v i t y ，i n d u c et h e
13、d i f f e r e n t i a t i n go fp r e a d i p o c y t e sa n dc a u s ew e i g h tg a i nb ya c t i v a t i n gt h et r a n s c r i p t i o nf a c t o rP e r o x i s o m ep r o l i fe r a t o r s a c t i v a t e dr e c e p t o r s2 ( P P A R T 2 ) N o wi ti sp r o v e dt h a tt h ep u e r a r i nc a
14、 ni m p r o v ei n s u l i nr e s i s t a n c e I ti Ss t i l ln o tc l e a ro ft h ep u e r a r i na c ti nw e i g h tg a i no ft y p e2d i a b e t e sp a t i e n t s A b o v ea l l ，i ti sm e a n i n g f u lt os t u d yt h ei n f l u e n c eo fp u e r a r i ni nt h ed i f f e r e n t i a t i n go
15、ft h ep r e a d i p o c y t e s M e t h o d s ：P r e a d i p o c y t e sw e r ep l a t e di n6 一w e l lc u l t u r ep l a t e sa tad e n s i t yo f 5 105 c e l l s w e l l A f t e r1d a y ，i tw o u l dr e a c hm a x i m a lc o n f l u e n c e T h e nt h ec e l l sw e r ec u l t u r e di n1m lo fD M
16、E Mc o n t a i n i n go f10 F C Sa t3 7 a n d5 C O ，f o r2d a y s T h e na d d0 5 m m o l LG A B A ，0 2 5 I t g m lD e x a m e t h a s o n ea n d1I _ t g m li n s u l i ni nt h em e d i u mf o r4 8 h ，t h e nc u l t u r et h ec e l l si nt h eD M E Mc o n t a i n i n go f1O F C Sa g a i n T h e4 0 1 x g m lp u e r a r i ns h o u l db ea d d e di n t ot h em e d i u mo nt h e1d a yo ft h ew h o l ei
