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1、脱 氧 核糖 核 酸 （ D N A .） 的制 备王尔中（ 中国科学院动物研究所）在实验生物学的研究中，D NA的制备已 成为一种常用的方法。根据实验材料和研究目 的不同，所用的制备方法也不同。本文主要介 绍质粒 D NA和其它 （ 动物组织、 细菌）D N A 常 用的制备方法 。一、质粒 D NA的制备质拉 ( p la s m i d ）是共价闭合环状的超螺旋 D N A 。它的碱基比例与染色体 D NA不同， 质 粒 D N A分子量小， 而染色体 D N A分子量大。根据这些特点，研究人员采用一些实验技术进 行提取纯化。常用的方法有以下几种。 （ 一） H i r t改良法 此方法
2、可以用来提取质粒 D N A或分子量 小的 D N A（ 如噬菌体、 病毒或线粒体D NA ) o 将细菌培养到3 X 1 0 5 细胞 毫升浓度（ 5 9 0mll 处0 D约为0 . 6 -0 . 8 ) 0 4 0C, 6 0 0 g 离心 1 0 分钟收集菌体。然后重新悬浮于5 倍体积的1 0 m M T r i s - H C 1 p H 8 .0 , 1 m M L D T A缓冲液中。轻轻摇动混合， 加2 0 毫克 毫升的链霉素蛋白酶 K ， 使最终浓度到5 0 微克 毫升。 然后再加1 0 务 的S D S ， 使最终浓度达1 多。 在3 7 下保温3 0 分钟，然后慢慢加人4
3、 M氯化钠，使最终浓度为 1 M（ 此步骤必须边加边摇） ， 混合均匀， 再于4 cC , 放置过夜。过夜后， 在4 0C, 1 0 0 0 0 g 离心 3 0 分 钟， 取上清液， 加入等体积的三氯甲烷一 异戊醇 ( 2 4 : 1 ) 混合液， 再加入等体积9 0 %的苯酚， 0 0C 下搅拌3 0 分钟， 再置于4 0 C , 1 5 0 0 g 离心 1 0 分 钟。吸出水相层， 加二倍体积冷乙醇( -2 0 c C ) , 于一2 0 放置过夜。过夜后， 在一1 0 0c, 1 o o o o g 离心 1 0 分钟。 将沉淀溶于少量 p H 8 . 1 的 1 0 .m M T
4、r i s - H C I , 5 0 m M 氯化钠 、0 . 1 m M E D T A缓冲液中。 （ 二） 非离子性乳化荆溶胞法t 此方法是用轻度溶胞法，可以使细菌细胞 的染色体 D N A仍然与细胞膜结合在一起， 这 样就能在低速离心中 将染色体 D N A与质粒 D N A分开。 非离子性乳化剂多氧乙烯十六烷醚（ 即B r ij 5 8 ) ， 可以用来分离质粒 D N A 。通常所使用的 蔗糖缓冲液和溶菌酶制备的细菌球形体，在脱 氧胆酸盐 （ D O C ）和 E D T A存在的情况下， 加人 B r i j 5 8溶胞， 在低速离心中绝大部分（ 9 0 外） 的染色体 D N
5、A会沉降下来， 而质粒 D N A保 持在上清液中。因为脱氧胆酸盐可以分解细胞 膜的脂蛋白 或脂多糖， 因此质粒 D N A可以与 细胞膜分离。 这一方法广泛应用于分离质粒 D NA与染色体 D NA . （ 三） 质粒DN A的提纯方法 一般地说， 上述两种方法分离的质粒D N A 都比较粗放，需进一步纯化。常用的纯化方法 有以下三种。1 两相法2 l 此方法是继冷酚法抽提之后，用酒精沉淀 出 D N A（ 还包括各种R N A ) 。它是一种专门提取闭合环状双链 D NA 的快速方法之一。 在供试D N A悬液中加人少量 I O m M T r i s - H C I , p H 8 .
6、0 , 1 m ME D T A缓冲液。在 1 0 0 加 热2 分钟后，迅速放入干冰一 酒精溶液中冷却。 然后加 2 -，倍体积的葡聚糖5 0 0 ( 1 6 . 8 多W/ W) , 1 . 2 5 倍体积的聚乙二醇6 0 0 0 ( 1 8 . 4 多W/ W） 和十分之一体积的0 . 5 M磷酸钠缓冲液p H 6 . 8 ,温度保持在4 0 C 。然后再加水，使体积成 为原体积的 ， 倍。充分混匀，在 4 下低速离32心，回收含有过量聚乙二醇的上清液。加入氯 化钠， 使最终浓度为0 . 2 A 1 后， 加二倍体积的酒 精， 使 D N A沉淀。沉淀用7 5 多的酒精洗后， 溶解于缓冲
7、溶液中。2 . 硝酸纤维素滤膜吸附法W 此方法主要是通过硝酸纤维素滤膜使单链 染色体 D N A与双链质粒 D NA分开，以达到 除去染色体D N A ， 纯化质粒D N A的目的。 经适当条件修剪后，可以使染色体 D N A 和质粒 D N A混合物中的染色体D N A成为碎 片，而质粒 D NA仍保持完整 （ 因为质粒分子 量小） 。如果这种切断的染色体 D N A和质粒 D N A受到高温或 P H 大于 1 1 . ， 的处理，破坏 染色体片段双链 D N A之间的氢键，使双链 D NA变成单链 D NA（ 即变性） ， 而质粒 D NA 因为呈闭合环状，不会发生单链变性现象。依据单链
8、 D NA可以被吸附在硝酸纤维素上， 而 双链 D N A不被吸附， 这样就可以使单链染色 体 D NA与双链质粒 D NA分开。 3 菲吮澳红氯化艳离心 菲咤嗅红 （ e t h i d u m b r o m i d e )氯化艳离 心可以除去残留少量染色体 D N A片段及一些 R N A ，得到纯净的质粒 D NA , 用离心收集的细胞， 添加乳化剂 因为 S D S 在氯化艳中不溶解，使用的乳化剂是十二烷 基 ( s a r k o s y l ）肌酸钠l ， 得到的溶胞产物直接加 氯化艳和菲咤澳红，并立即在1 0 9 C , 1 6 0 0 0 0 g 条件下进行4 0 小时的密度
9、梯度离心。 分离结 果， 闭合环状 D N A由于可以与更多的菲咤澳红结合， 因而密度大， 能够与开放环状 D NA和 线状 D N A（ 如染色体 D NA ）分开。 用异丙 醇处理从梯度中收集到的含有质粒 D N A的区 带，以便除去菲咤澳红。然后再用渗透法将氯 化艳透析出去， 这样就可以得到纯的质粒D N A .二、其它D N A（ 动物组织、 细菌） 的制备（ 一） 从组织中提取 D N A 用二份组织加入一份 p H 7 的缓冲液（ 内含 4 . 4 克柠檬酸，8 . 7 克氯化钠，溶于 1 0 0 毫升水中） 。4 0 C 、 匀浆3 分钟， 1 0 0 0 g 离心 1 ， 分钟
10、， 弃 去上清液（ 此步骤重复两次） 。沉淀加9 毫升缓 冲液， 用磁力搅拌器搅匀， 再加九分之一体积的十二烷基硫酸钠 （ 简称 S D S ) ，再将它溶 解 在 4 5 %酒精里， 室温下轻微搅动一小时。缓慢加 人5 的固态氯化钠， 并继续在室温下搅动， 后 于4 放置过夜。过夜后4 下 3 9 0 0 叱离心二 小时。取上清液逐滴加入二倍体积的无水酒精 （ 同时轻微搅拌） ， 用玻璃棒卷起 D NA纤维， 然 后用7 5 酒精洗数次。 （ 二） 染色体 DN A 的分离3 1 收集细胞（ 2 -3 X 1 0 细胞 毫升） ， 用冷的 亨克民平衡盐溶液 （ B S S )清洗三次后， 加
11、人皂 草贰( s a p o n i n ) ， 使最终浓度为 0 . 3 多。静置5 分 钟后， 再用 B S S洗二次。悬浮于 S S C（ 即0 . 5 m 氯化钠， 0 . 0 1 5 M柠檬酸钠中） ， 再加 S D S ，使浓 度达0 . 2 沁。 在澄清粘液中， 加人核糖核酸酶A （ 即R Na s e A 1 0 0 微克 毫升） 和核糖核酸酶 T l ( R N a se T t 5 0 单位 毫升） ， 3 7 保温一小时。（ 其中R Na s e A预先加热至9 5 0 C , 1 ， 分钟， 以使可能污染的 D N a s e活性失活） 。然后加广谱蛋白酶( p r o
12、 n a s e 3 毫克 毫升） ，继续在 3 7 保温 1 2 小时 。此 溶液用氯仿一 异戊醇 ( 2 4 : 1 V / V ）提取三次后， 用0 . 1 X S S C透析。此法提取的 D N A的大小大约在 4 X 1 0 道尔顿左右。 （ 三） 从细胞核中提取 DN A 一克细胞或组织加入1 0 毫升 p H 8 . 0 的1 0 rr m T r is - H C 1 , l O m M MgCl2, 2 4 m M K C 1 和1 r s M二琉基苏糖醇( D T T ) 缓冲液。使用 D o u n c e匀浆器匀浆，并用显微镜检验细胞是否破碎。 在4 0 C , 6 0
13、 0 g 离心 1 0 分钟， 将沉淀物悬浮于 1 0 毫升0 . 3 4 M蔗糖及 0 . 2 5 M精眯（ s p e r mid i n e ) 溶 液中， 再在4 0 C 6 0 0 g 条件下离心1 0 分钟， 收集 到的沉淀物为细胞核。 沉淀的细胞核重新悬浮于1 毫升 1 0 m m E D T A和p H 1 0 . 4 的 l o m m磷酸钙 ( C a 3 ( P 0 4 ) z ) 缓冲液中。加 1 毫升2 %的十二烷基肌酸钠， 溶 解细胞核， 并轻轻地在2 0 -2 5 下摇动5 分钟。 溶解后的细胞核溶液放人密度为1 . 6 1 的氯化艳33溶液中， 在2 0 0 C
14、 1 6 0 0 0 0 g 条件下离心7 2 小时。 收集含有 D N A区带的部分，装入透析袋里，用 I O m M E D T A 和 1 0 0 m M T r i s - HC I p H 8 .0 缓冲液透析。 （ 四） 冷酚法 将离心收集的细胞悬浮于 p H 7 . 4 的0 . 1 5 M 氯化钠和O . 1 M E D T A中。加 1 毫克 毫升的蛋 白酶K ( p r o n a s e K ) ， 再加2 0 关的 S D S ，使最终 浓度为0 .3 并， 在 3 7 保温1 6 小时。加等体积 的重蒸酚，抽提三次。用十分之一浓度的 S S C 透析水相三到五次。 （
15、 五） 折染色体的提取法 大肠杆菌细胞在4 下离心收集之后。O CC 下悬浮于0 . ， 毫升p H 8 . 2 缓冲液（ I O m M T r i s - H C I , 0 . 1 MN a C I和2 0 多蔗糖溶液） 中。 加入溶菌酶 ( 0 . 1 毫升含有4 毫克 毫升溶 菌酶、 0 . 1 2 M T r is - H C I , p H7 . 2 和 0 . 0 5 M E D T A ) , 在冰上放置4 0秒。 紧接着加入 0 .5毫升 1 多 B r i j- 5 8 , 0 . 4 %脱氧胆酸盐、0 . 0 1 M E D T A和l o m m 精眯 H C I 溶
16、液 。细胞在 1 0 下处理三分钟被溶解。 溶解的细胞用 1 2 -6 0 多蔗糖梯度 （ 含有 0 . 0 1 M T r is - H C I , p H 8 . 2 1 m M二疏基乙醇, 1 M M E D T A和 ， M M M g C 1z ) ，在4 下a 9 0 0 0 g 离 心片分钟， 离心管中出现三条带（ 上、 中、 下） ， 用 吸管吸出离心管中间出现一条乳白色的带，这 部份就是折叠的染色体 D N A , 需要立即进行 实验， 否则大约3 0 分钟后它就会失去折叠的特 性。上述几个方法是分离制备 D NA比较常用 的方法。除此之外， 还有酸酚提取法， 碱变性制 备法等都是根据 D N A的性质分离制备的。因 此，在应用上可以依据实验本身客观条件不同选择使用。参考文献 1 C l o w e s , R . C . , 1 9 7 2 . B a c t e r i o l o g i c a l B e r i e ic s , 3 6 : 3 6 1
