《油桐delta8脱饱和酶基因的全长cDNA克隆及序列分析》由会员分享，可在线阅读，更多相关《油桐delta8脱饱和酶基因的全长cDNA克隆及序列分析（6页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、Vol. 35 No. 7 July. 2015第 35 卷 第 7 期 2015 年 7 月 中 南 林 业 科 技 大 学 学 报Journal of Central South University of Forestry delta 8 desaturase; degenerate PCR; RACE; gene cloning13第 35 卷中 南 林 业 科 技 大 学 学 报脱饱和酶基因，瞬时表达结果显示，此基因在胚乳发育早期有较高表达，在细嫩叶片和细嫩果实的青果皮中表达量较低，在其它时期的组织器官中不表达。可能是一个结合在内质网膜上的 delta 8 脱饱和酶基因，与细胞的信号
2、传递途径有关，具有潜在研究价值。1 材料与方法1.1 材 料2009 年 8 月底，以湖南省长沙市天际岭林场对年桐果实为材料， 80超低温冰箱保存。大肠杆菌 DH5，质粒载体 pMD18-T、rTaq DNA 聚合酶、10PCR Buffer（with Mg2+）、Pyrobest DNA Polymerase 购 自 Takara，3 RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends，5RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends，PureLinkTM Micro-to-Midi Total
3、RNA Purification System 购自 Invitrogen，First Strand cDNA Synthesis kit 购自 Fermentas，pEASY-Blunt Simple Cloning Kit 购自全式金公司，其它常规试剂均使用国产分析纯。1.2 方 法1.2.1 油桐种子总 RNA 提取以Invitrogen Total RNA Purification Kit为基础，采用 cTAB 裂解进行改进，先取配制好的 1.2 mL CTAB 裂 解 液（3% CTAB，1.5 M NaCl，10 mM EDTA，30 mM Tris，pH 7.0, 2% pvp-
4、40）加入到1.5 mL 无 RNase 的离心管中，加 20 L - 巯基乙醇。65 预热 10 min。在液氮中将油桐种子研磨充分，装入预冷的 1.5 mL 的离心管中（每管不多于 250 mg）。向离心管迅速加入 600 L 预热好的CTAB 裂解液，涡旋混匀，65 加热 10 min，每3 min 涡旋 1 次。加入 600 L 的氯仿，涡旋振荡4 min，使其充分裂解。后续步骤参照 Invitrogen RNA 试剂盒说明书。 1.2.2 单链 cDNA 的合成 油桐种子单链 cDNA 合成参照 Fermentas 试剂盒说明书进行。 1.2.3 简并片段的扩增根 据 GeneBan
5、k 中 登 录 的 delta 8 脱 饱 和 酶基因氨基酸序列（Jatropha curcas ABP01349.1、 Ricinus communis XP_002511936.1、Brassica napus CAA11857.1、Helianthus annuus CAA60621.1、Arabidopsis thaliana NP_191717.1）设计简并引物扩增 JBD8F（GATTGGRYNAAAGANCATCC），JBD8R（TTATGVKTCCATTTCCACCA）， 扩 增delta 8 基因的保守区片段。50 L PCR 反应体系包含 5 L 的 10PCR Buffe
6、r（with Mg2+），4 L的 dNTP Mix( 各 2.5 mM)， 各 1 L 的 JBD8F、JBD8R 引物 (20 M)，0.25 L rTaq(5 U/L)，2 L单链 cDNA 模板，36.75 L 超纯水。PCR 反应条件为 94 预变性 5 min；94变性 30 s，55 退火 30 s，72 延伸 1 min，35 个循环；72 继续延伸 7 min；16 终止反应。 1.2.4 3RACE 扩增根 据 已 扩 增 的 delta 8 保 守 序 列， 设 计了 3 RACE 引物 3R-P1（TGAATCTGGCTGG CCAAGATGTAAC），3R-P2（CA
7、AAGTCTCAG ATGTGTCCAGGGA），3R-P3（TCATTGGCATC TGTTGTGTTCTTGT）； 根 据 Invitrogen 的 3 RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends手册合成 3RACE Ready cDNA 并进行 3RACE 巢式扩增。 1.2.5 5RACE 扩增将 根 据 已 扩 增 的 delta 8 保 守 序 列 及 3 RACE 片段的测序结果设计 5 RACE 引物 5R-P1（CATTCCCATTTGGAGGTC），5R-P2（AG CAGCAAAGGAAGTAAGCACG），5R-P3
8、（ATGGTTCCATTTCCACCAAG），5R-P4（TCCCTGGACACATCTGAGACTT），根据Invitrogen 的 5 RACE 手 册 进 行 5 RACE ready cDNA 的合成及巢式扩增。 1.2.6 完整 cDNA 的克隆测序将 delta 8 的 保 守 区 片 段 及 3 RACE 和 5 RACE 片段进行人工拼接，得到 delta 8 基因的理论全长 cDNA 序列，以此设计完整 ORF 扩增引 物 QC-F（ATGGAGGGAGAAAGGAAGT），QC-R（GGCTTCAAAGGCAACATAGA）。 以 反转录的 cDNA 第一链为模板，进行 P
9、CR 扩增，50 L PCR 反应体系包含 5 L 10Pyrobest Buffer II（with Mg2+），4 L dNTP Mix( 各 2.5 mM)，各 1 L 的 QC-F、QC-R(20 M) 引物，0.25 L Pyrobest DNA Polymerase（5U/ul），2 L 单 链 cDNA 模板，36.75 L 无菌水。PCR 程序为：95预变性5 min；95 变性 40 s，58退火 40 s，72 延伸3 min， 35个循环；72 延伸10 min；4 终止反应。将扩增产物进行回收、连接、转化，并进行双向测序。龙洪旭，等：油桐 delta 8 脱饱和酶基因的
10、全长 cDNA 克隆及序列分析14第 7 期2 结果与分析2.1 delta 8 基因保守区序列扩增使用 cTAB 裂解法配合 Invitrogen 植物 RNA提取试剂盒，提取的油桐总 RNA，如图 1 所示，28S 与 18S 条带明亮，效果理想，满足实验要求。板，用编码区引物 QC-F、QC-R 进行 Delta 8 基因的完整 ORF PCR 扩增，1.2% 的琼脂糖凝胶电泳结果如图5所示， 获得一条特异的条带， 经测序确认，此条带大小为 1 400 bp，与预期结果吻合。根据测序结果进行后续分析。图 1 油桐种子总 RNA 琼脂糖凝胶电泳 Fig.1 Electrophoresis
11、of Venicia fordii seed total RNA图 5 delta-8 的 RT-PCR 产物电泳检测 Fig.5 Electrophoresis of RT-PCR products amplification of delta-8 gene图 2 delta 8 简并 PCR 电泳 Fig.2 Electrophoresis of delta 8 degenerate PCR product amplification图 4 5RACE 产物电泳检测 Fig.4 Electrophoresis of 5 RACE products amplification图 3 3RAC
12、E 产物的电泳检测 Fig.3 Electrophoresis of 3 RACE products amplification 以 此 单 链 cDNA 为 模 板， 用 简 并 引 物JBD8F、JBD8R 进行 PCR 扩增。取 3 L PCR 产物，于 1.5% 的琼脂糖凝胶上电泳，得到与预期大小相符的清晰条带（图 2）。经过测序确认，此片段长490 bp。可根据此部分保守序列设计 RACE 扩增所需引物。2.2 3RACE 扩增和 5RACE 扩增以 引 物 3R-P1、3R-P2、3R-P3 与 Invitrogen 3RACE 试剂盒进行巢式 PCR 扩增，1.5% 琼脂糖凝胶电
13、泳，最后由 3R-P3 扩增得到 3RACE 清晰特异条带，经回收测序，确定序列长度 1200bp（图3），与预期相符。用引物 5R-P2、5R-P3、5R-P4 与 Invitrogen 5RACE 试剂盒进行巢式 PCR 扩增，将产物进行 1.5% 琼脂糖凝胶电泳，如图 4 所示，由 5R-P4 得到特异的 550bp 左右的条带，经回收测序确定为预期片段。2.3 CDS 扩增电泳检测以提取油桐种子总 RNA 反转录的 cDNA 为模2.4 Delta 8 基因的序列分析对 delta 8 基因全长 cDNA 测序结果进行拼接后分析，如图 6 所示，delta 8 基因全长 1 787 b
14、p，ORF 的长度为 1 344 bp，编码 447 个氨基酸，5 非编码区长 243 bp，3 非编码区的长度为 200 bp，3末端有 14 个多聚 A 的 poly A 尾。油桐 delta 8 基因全长 cDNA 序列在 NCBI 的Blastn结果如表1所示，从表中的数据可得知油桐与蓖麻的 fatty acid desaturase(putative) 相似性最高，达15第 35 卷中 南 林 业 科 技 大 学 学 报下划线斜体 ATG、TAA 分别表示起始密码子和终止密码子，波浪线所示为多聚 A 尾，推导的氨基酸序列在核苷酸序列下方， 方框标示为引物 5R-P4 和 3R-P3，
15、波浪线标示为 poly(A) 尾 图 6 油桐 delta-8 全长 cDNA 序列及推导氨基酸序列 Fig.6 Nucleotide sequences and deduced amino acid sequences of Delta-8 cDNA from V. fordii表 1 delta-8 全长cDNA序列的Blastn结果Table 1 Blastn results of full-length cDNA of delta-8 植物名基因名登录号相 似 性Ricinus communis( 蓖麻 )fatty acid desaturase, putativeXM_002511890.11 184/1 421(83%)Populus trichocarpa( 毛果杨 )fatty acid desaturase/cytochrome b5 fusion proteinXM_002302577.21 145/1 393(82%)Populus tomentosa( 毛白杨 )delta8-sphingolipid desaturase (D8A)KC689910.11 103/1 343(82%)Populus trichocarpa( 毛果杨 )hypothetical proteinXM_002320798.21 110/1 357(82%)
