实验sirna的设计,合成

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1、线路二：哺乳动物细胞线路二：哺乳动物细胞 RNAi 实验：实验：siRNA 的设计，合成的设计，合成 前面说过，哺乳动物细胞导入 30bp 以上的长双链 RNA（dsRNAs）往往会诱发非预期的抗病毒应答反应， 所以不能用体外合成长的 dsRNA直接导入细胞。 常见的做法之一是直接制备 1927bp左右的 siRNAs，然后再将 siRNAs 转入哺乳动物细胞。 siRNA 的设计是决定 RNAi 实验成败关键性的第一步。虽然 siRNA 设计法则在不断地完善，可是并非每个设计出来的 siRNA 一定能有效沉默目标基因的表达，也没有办法100预测设计出来的 siRNA 是否有效， 所以设计出来

2、的 siRNA 都必须经过实验证实。 直接购买已经证实有效的 siRNAs，好处是已经厂家荧光定量 RT-PCR 预证有效，无需设计、合成和验证，无需顾虑 siRNA 是否有效， 便于研究人员把全部精力集中到目标基因功能的研究上， 而不需要花费在其他地方在全球科学家争分夺秒抢夺基因功能研究成果和专利的今天， 时间就是金钱， 为什么要把宝贵的时间和精力浪费在反复琢磨如何设计和验证 siRNA 上呢？除非你立志成为siRNA 设计专家。 专业的设计， 高质量的合成和纯化， 往往只需要很低的浓度就可以达到不错的基因沉默效果， 也有助于减少脱靶等非预期反应需要特别说明的是大多数 siRNA 不能达到1

3、00%沉默基因表达的效果-毕竟不是基因彻底敲除，只是在转录后水平降解 mRNA，再加上siRNA转染本身很难保证100%的细胞被成功转染， 未转染细胞在检测时也会影响结果-以RNAi试剂领域两大领先厂家Ambion和 Qiagen 为例，他们把能降低目标基因表达70%以上的 siRNA 称为有效，也有些公司的标准更高，如 Bio-Rad 标准是减低目标基因85%的表达，Dharmacon 和 Sigma 标准则是75%。siRNA 算是非常高效的，只需很低的浓度就可沉默基因表达， 达到有效浓度后再增加也不会提高基因沉默的效果， 反而研究结果表明过高浓度的 siRNA（超过 100nM 以上）还

4、有可能导致非预期的脱靶反应。所以在实验中， 通常就需要摸条件， 以有效的最低浓度为最适浓度以期减少非特异反应。 因此在购买现成的 siRNA，同样的包装量， 有效工作浓度不同， 每次使用的成本就不用，比如 Bio-Rad 的 27bp siRNA 保证工作浓度是 5nM，Ambion 的保证有效的最高工作浓度是 30nM，多数厂家是 100nM，如果是荧光标记的 siRNA 工作浓度通常达到 100nM。假设同样的量，就算 Bio-Rad 的 27bp siRNA 比100nM 工作浓度的其他品牌 siRNA 产品贵上20 倍，二者每次实验使用成本也是一样的！因此， 在考虑价格和包装时也要同时

5、留意其有效工作浓度， 才好比较价格。 当然也需要同时考虑评估标准是用哪种细胞株。以 Qiagen 的资料为例，其验证 siRNA 用于 Hela、A549细胞工作浓度为 5nM 足够，用于 HepG2、HEK293、MCF-7 细胞则需要用到 25nM。 虽然很多厂家如 Qiagen 等都在持续进行siRNA 验证工作，以满足更多研究人员的需求， 但是毕竟预证有效的 siRNA 还是有限的，如果你的基因并不在此范围内， 你也可以选择 1. 厂家设计定制厂家设计定制-只要提供基因的信息，即可由厂家设计合成纯化， 还可以按要求修饰和 生物通 第 14 页ebioTech特刊标记。多个厂家提供 N

6、CBI 的 RefSeq 数据库中已有的人类，大鼠或者小鼠的全部基因的siRNA 定制合成服务，生物通在后面会介绍。对同一个基因通常需要设计 3-5 个不同的siRNA以保证其中至少2个siRNA是有效的，同时可做相互对照。同一基因定制多个siRNA，相比设计合成单个 siRNA，厂家也会有“套餐”优惠 2. 自己设计再叫厂家合成自己设计再叫厂家合成-如果研究对象不在此列，也可以采用网上免费的 siRNA 在线设计工具来设计， 生物通在随后附录一些在线工具的地址以供参考。 不过， 别指望用不同的设计工具对同一序列设计一定会得到类似的结果-不同的在线工具有不同的设计法则和评分标准， 同一序列用不

7、同的在线工具设计得到的结果也可能各不相同 生物通生物通 ebioTips 6：好的实验设计应该至少选择 2 个以上针对同一目标基因的有效有效siRNAs 同时平行做实验，以相互验证实验结果确实是由于目标基因沉默而引起的， 并非个别 siRNA 的特异现象。严谨的实验态度是可靠结果的保证。 如果未知是否有效， 针对同一个基因选择 3-5 个 siRNA 平行实验是非常有必要的。自 03 年以来，不少文章从浓度、siRNA 作用机制上阐述了导致脱靶反应的原因，这种平行对照更加显得必不可少。 1.商品化商品化 siRNAs： 已经纯化、买来即用的 siRNAs，简单方便，适合瞬时基因沉默而不适合做长

8、期沉默，不能重复使用。 分为预证siRNA和定制siRNA.两种， 前者厂家预证有效， 后者根据一定法则厂家设计，但是未经实验证实-不过通常能保证 3 个设计中至少 2 个有效， 或者 5 个里有3 个有效 （目标基因 70%表达沉默称为有效） 。合成好的 siRNA 通常以冻干或者溶液状态提供，虽然 siRNA 可以在 4C 条件下稳定 2周，最好还是放-20C 冰箱，避免反复冻融，可稳定 6M 左右。 若要长期保存以冻干形式为好。对于定制合成 siRNA，通常可以选择标准纯度 （85%） ， HPLC 纯化 （97%） ， PAGE纯度（97%）和体内实验纯度。即使是标准纯度的 siRNA

9、 也需要经过 MALDI-TOF 质谱和 HPLC 分析，退火后经过 PAGE 分析的，如果合成量不大， 标准纯度已经足够普通的体外实验用，如果起始合成量较大，40nmol 以上或者经过修饰的 siRNA，则最好选择经过HPLC 纯化。 如果是计划做体内实验则需要购买去除内毒素，彻底脱盐的 siRNA。商品化的 siRNA 的量，国外厂家多以 siRNA 产物nmol数标识 （Invitrogen是以合成量来标识的，不同的纯化方法得到的产量有不同） ， 而国内的合成厂家则喜欢用 OD 值表示-由于 OD值读数易受产物中的其他成分影响， 因此需要留意产物纯化方式。 参考 Sigma 的数据， 1

10、OD的 19-23bp 产物差不多相当于 5nmol， 可做 75次 24 孔板转染， 上海吉玛的数据则是 1OD 产物差不多相当于 2.5nmol。 Qiagen 自从几年前收购了全球知名的RNA合成厂家Xeragon， 凭借Xeragon在RNA合成领域的雄厚技术实力和声望，成功进军siRNA 合成领域并迅速取得了领先地位。利用 BIOPREDsi 法则进行设计，Qiagen 的 HP Validated siRNAs 正在进行全球最大规模的siRNA 验证工作，已经得到验证的有超过2000 多个人类基因的 3500 多个有效 siRNAs。每个 siRNA 都经过至少 4 次独立转染，每

11、次双份的转染实验从而得到 8 个基因沉默效率的数据， 每次独立转染都必须经过比较同一个正对照(MAPK)的基因沉默效率（70%以上为有效） 进行每次转染效率间的平衡、 荧光定量 生物通 第 15 页ebioTech特刊RT-PCR 同时检测目标基因和。 经过和未转染细胞之间的比较，得到的数据经过 CT 和管家基因 GAPDH 作为内参进行平衡，定量PCR 还要通过实验排除污染，引物二聚体，引物发夹结构的影响，甚至连每个目标mRNA 的溶解曲线也进行监控。这样得到最后能满足沉默效率在 70%以上的 siRNA 才能被保留入选。 这样严格的产业标准是一般实验室所无法实现的。现在 Qiagen 开

12、放提供详细序列信息，每个 siRNA 5nmol 报价 Y4678，按照去年价格战的折扣，不到 3000。Qiagen网站上还有 FlexiTube 订购组合，一次订购 4个以上， 每个 siRNA 1nmol 价格 90 美元不到，以如此严谨的评估标准得到保证有效的siRNA，这个价格性价比颇高。1nmol 大约相当于 13-15ug siRNA。 已经验证的 siRNA 毕竟很有限，各厂家还有一种由厂家根据用户目标基因， 提供设计合成服务的 Pre-designed 的 siRNA， 虽然没有验证，但是经专家设计，并经过严谨筛选，成功率高，也很省事-对于研究基因功能的研究人员来说， 集中精

13、力专心研究目标基因的功能，尽快发表研究成果才是主要目标。以Qiagen 为例，提供针对人类，小鼠，大鼠几乎全部基因的 siRNAs 设计合成。所有设计的序列都经过严格筛选： -筛选最新基因组同源序列，以避免脱靶反应； -SNP 筛选以避开 SNP 位点， -干扰素结构域分析：已知一些结构域会引发干扰素相应，包含这些结构域的 siRNA 要被剔除。 Hornung et al （.Nature Medicine 2006）研究表明免疫细胞， 特别是浆细胞样树突状细胞（plasmacytoid dendritic cells）内吞 siRNA后会分泌 I 型干扰素。 作者还鉴别了 9 个碱基的结构

14、域特别容易引发 IFN-I 分泌。所以，如果 siRNA 会进入血液就要特别小心避免这类结构。 -3UTR seed region 分析：有文章表明，某些 siRNA 反义链的 seed region(反义链的的2-8 个碱基)和一些非目标 mRNA 的 3非编码区不完全匹配（imperfect matches）时有可能导致脱靶反应，使得非目标 mRNA 也发生降解。原因是这种 siRNA 可能模拟一个 miRNA作用。Qiagen 的设计会对 RefSeq 数据库中人类大鼠和小鼠的 3UTR 序列和 siRNA seed region 的互补性进行分析， 并尽量避开潜在可能出问题的序列。 （

15、生物通编者注：完全避免这种 imperfect matches 很难， 并且匹配并非意味必然会导致问题出现。 只是在筛选过程中尽量避免潜在可能出问题的序列。） 这种Pre-designed siRNA单个报价不便宜。 不过由于一个基因通常需要 3-5 个siRNAs同时平行实验，Qiagen提供的FlexiTube GeneSolution一次订购 4 个不同的 1nmol的Pre-designed siRNA，总价格不到 300 美元，价格直逼国内siRNA合成价格， 加上著名厂家设计合成，还是有吸引力的。Qiagen还有提供一种根据已发表文献公布的siRNA序列合成的商品，如果自己能找到文

16、献也可以直接合成。Xeragon独有的TOM RNA合成专利使得合成siRNA纯度 90%以上。 Ambion独立的Silencer Validated siRNAs预证siRNAs，已经实验验证能有效沉默目标基因 70%或以上，大小为 21bp；3末端以UU结尾，涵盖人类 400 多个基因（ 5nmol和20nmol两种冻干粉包装提供。要特别说明的是，由于Ambion的siRNA3末端突出都是UU结尾的，完全模拟自然存在的siRNA，由于在化学合成的过程中，添加U的试剂成本 生物通 第 16 页ebioTech特刊要比 T 贵得多，难度大，UU 末端合成成本要远远高于 TT 末端或者其他末端， 因此你会发现， Ambion 的商品 siRNA 要比其他品牌贵不少， 有如川菜一般劲辣。 同样的， 在设计 siRNA