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1、1复方大果木姜子乳膏体外抗 HSV1病毒的实验研究【摘要 】 目的通过对复方大果木姜子软膏号、号、号 3个制剂处方水提、醇提物体外抗 HSV1 病毒作用的研究，优选出一个最佳组方提取工艺，为进一步将其开发成一种安全有效的治疗单纯性疱疹病毒的中药新药提供依据。方法通过细胞培养法，采用观察细胞病变(CPE) 和噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞活性，观察复方大果木姜子软膏提取物抗 HSV 病毒感染的作用；以治疗指数（TI ）为评价指标，比较各处方的抗病毒活性强弱。结果复方大果木姜子软膏号，号，号三个处方其水煎液及醇提液都有不同程度的体外抑制 HSV1 在 Hep2 细胞中增殖的作用；其中 号处方的水提
2、取物作用最强。结论 选用复方大果木姜子软膏号处方采用水煎提取作为制剂研究的最优处方工艺。 【关键词】 复方大果木姜子软膏； 细胞培养实验方法； 抗病毒活性； 处方筛选大果木姜子 Cinnamomum migao H. W. Li 系樟科樟属植物米槁的干燥果实，是贵州十大苗药之一。现有的研究表明，大果木姜2子具有增加血循环、改善心肌缺血、抗流感病毒14 等作用。通过前期的实验研究已证明了大果木姜子精油具有良好的体外抗病毒作用（大果木姜子精油体外抗 HSV1 病毒实验研究 待发表） ，为将其更好地开发为一种治疗单纯性疱疹病毒的复方药物，本研究采用细胞培养技术对大果木姜子精油与其它药物组成的号，号，
3、号 3 个处方，进行抗 HSV1 病毒活性研究，现将实验结果报道如下。1 材料与仪器1.1 试剂材料RPMI1640 培养（GIBCO 公司） ；胰酶（GIBCO 公司） ；新生牛血清（杭州四季青生物制剂公司） ；平衡盐液：Hanks 液；噻唑盐（MTT ，北京天港邦定生物医学科技有限公司） ，其它试剂均为分析纯。MTT 溶液：称取 50 mgMTT，放入小烧杯中，加入 50 ml 维持液，过 0.22 m 的微孔滤膜过滤除菌，分装于小试管中，放于4冷藏室中保存，两周内有效。RPMI1640 培养液：含 10%新生牛血清的 RPMI1640 培养液3（含 1105 uL-1 青霉素，100 m
4、gL-1 链霉素，0.2%heps） 。维持液：成分同营养液，但小牛血清浓度为 2%。临用前用 5.5%碳酸氢钠液调 pH 值为 7.4，4 冰箱保存备用。消化液：胰蛋白酶液（0.25%胰蛋白酶加入 0.01%EDTA，0.22 m 的微孔滤器除菌） 。使用前用 5.5%NaHCO3 调整 pH 值为7.6。1.2 药物的制备以大果木姜子精油为主，分别配伍：珊瑚姜、杠板归、飞龙掌血、苦参、土荆皮、蛇床子、花椒等药物组成号方。号、号、号试验药物用 70%的乙醇加热回流提取号，号，号 3 个处方，另加入超临界萃取的大果木姜子精油及 0.5%吐温 80 作为增溶剂，搅拌混匀，即得。号，号，号试验药物
5、用水煎煮提取号，号，号 3 个处方，另加入超临界萃取的大果木姜子精油及 0.5%吐温80 作为增溶剂，搅拌混匀，即得。以上药物用 0.22 m 的微孔滤器除菌。本实验中所列药物的浓度是按原生药浓度计算（大果木姜子精油按出油率为 10%计算） 。1.3 仪器二氧化碳细胞培养箱(Thermo electron corporation)；超净工作台(苏州净化设备厂)；数字照相机：Nikon digital camra TEF1200F；倒置显微镜：尼康 TS100F；低速离4心机：LD42( 北京医用离心机厂) ；通用酶标仪 BIOTEX ELX800 uv（美国产品） 。1.4 细胞细胞株：Hep
6、2 人喉癌细胞(细胞株由贵阳医学院免疫学教研室保存)。1.5 病毒株病毒株： HSV1，由贵阳医学院基础医学院 组织培养及干细胞研究中心提供。在 Hep2 细胞上复壮三代，传代增殖后，分装使用。2 方法2.1 病毒滴度的测定用含 2%新生牛血清的 RPMI1640 维持液将病毒稀释成10，102，103，104，105，106，107 ，108 ，109，1010 倍 10个浓度，按常量分别加入已长成单层细胞的 96 孔细胞培养板中，置于 37，5%CO2 温箱内孵育 2 h，弃去含病毒维持液，更换正常细胞培养液，继续培养，分别于 1，2 ， 3，4，5，6 ，7 d 在倒置显微镜下观察记录细
7、胞病变(CPE)程度。同时正常细胞对照。计算细胞半数感染量(TCID50) 。2.2 药物对细胞的毒性检测细胞用胰酶消化后，用培养液配5成细胞密度为 1105/ml 单细胞悬液，接种于平底型 96 孔培养板中（每孔加入 0.2 ml） ，适应生长 24 h，至细胞生长呈单层。号药液分别用维持液进行二倍量系列稀释，把不同浓度的药液加入到培养板中（100 l/孔） ，每个剂量组设 4 孔细胞。用透明胶带封口后，置于培养箱中继续培养，同时设另设正常细胞。培养72 h 后，观察细胞病变(CPE)情况；并用噻唑蓝(MTT)比色法5检测细胞活性计算存活细胞的百分比。按 Reed-Meuench 法计算各处
8、方药物对细胞的半数毒性浓度(50% Cytotoxity Concentration,CC50)。细胞存活率(%)= 试验孔平均 OD 值对照孔平均 OD 值100%药物对细胞生长的半数毒性浓度(CC50)CC50AntilogB + （50 - 50%抑制百分率-50%抑制百分率）C式中 C=A-B；A=log(50%药物浓度)；B=log(50%药物浓度)2.3 测定各处方对 HSV1 病毒液的治疗作用除第 1 列外（正常细胞对照列）其余各孔将 100 TCID50 浓度的 HSV1 病毒稀释液 0.1 ml 加入到已生长呈单层细胞的 96 孔细胞培养板中，于37，5%CO2 孵箱中吸附
9、2 h 后。分别加入用维持液将号制剂药液已稀释成不同浓度的制剂溶液 0.1 ml/孔，每个浓度 4 孔，每种剂量组孔设 4 个重复孔，同时设细胞对照及病毒对照。放入637，5%CO2 培养箱中培养 72 h，按上述 MTT 比色法测定细胞的活性，计算存活细胞的百分比。按 Reed-Meuench 法计算各处方对病毒治疗的半数有效浓度(50% Effective Concentration，EC50)。病毒抑制率的计算：病毒抑制率%= 实验孔 (药物+病毒)平均 OD 值- 病毒对照孔平均值(细胞对照孔平均值-病毒对照孔平均值100%药物对细胞生长的半数有效浓度(EC50)EC50Antilog
10、B+（50 - 50%抑制百分率/ 50%抑制百分率- 50% 抑制百分率）C 式中 C=A-B；A=log(50%药物浓度)；B=log( 50%药物浓度)。3 结 果3.1 病毒滴度通过 Reed-Meuench 法计算病毒的半数感染量 TCID50 为 105/100l。实验使用病毒攻击量为 100 TCID50。3.2 药物对细胞的毒性通过观察号制剂药液的最大无7毒浓度 CC0 分别为：100 mg/ml；、号制剂 CC0 分别为 50 mg/ml。MTT 法测定细胞存活率显示号制剂药液在浓度分别为 100 mg/ml 时，细胞的抑制率为102%，88%，91%， 80%；号制剂在浓度
11、 50mg/ml 时，细胞的抑制率为 90%，76.1%，说明在此浓度下对细胞已基本没有毒性。号制剂的半数细胞毒性浓度（CC50）分别为：200， 200， 200 ，200，122.6 ，95.5 mg/ml。3.3 制剂处方对 HSV1 病毒的治疗作用实验结果表明，号制剂处方在不同浓度下，都具有降低 HSV1 所致的 CPE作用，且病毒抑制率随着药物浓度增加与药物浓度呈正相关。根据公式 TI=CC50/EC50，通过实验计算出各处方制剂体外抗 HSV1病毒的治疗指数。号制剂体外抗 HSV1 病毒疗效结果见表1。表 1 实验药物体外抗 HSV1 病毒疗效对比（略）号制剂处方制剂都有对病毒治疗
12、作用；其中号制剂处方MIC 浓度最小，治疗指数最大：256.44 讨论4.1 对于药物的评价需要考虑其药效与毒力的相对关系，这个相对关系可用 TI 表示。以治疗指数 TI 作为分析判断指标，结果：8号制剂液最优，即用号处方水煎提取工艺，体外抗病毒疗效最优。4.2 增溶剂空白对照实验证明，吐温80 在浓度为 0.125%时，培养 72 h 后，细胞没有出现细胞病变情况；且对病毒没有产生明显的抑杀作用，说明选用吐温80 作为增溶剂是可行的。4.3 实验结果表明各处方对 HSV-1 病毒的抑制都有一定的治疗作用，且治疗作用与药物的浓度呈明显的量-效关系。【参考文献】1覃仁安，孙学蕙，邱德文.米槁心乐滴丸抗心肌缺血作用的实验研究J.中国药房，1997，8（6 ）：251.2孙学蕙，隋艳华，邱德文. 大果木浆子油对麻醉猫血流动力学的影响J.中国中药杂志，1995，20（10 ）：622 .3孙学蕙，叶家齐，冯兴芬，等.大果木浆子油对离体内脏平滑肌的药理作用J.中药药理与临床，1990，6（2 ）：32.4邱德文，谢宝忠，孟宪容，等大龙合剂抗流感病毒的实验研究J.贵阳中医学院学报，1991， （2）：53.95张卓然. 实用细胞培养技术，第 1 版M.北京：人民卫生出版社，1997.
