蛋白质工程及植物基因工程

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1、国家重点实验室介绍北京大学蛋白质工程及植物基因工程 国家重点实验室1 概况北京大学蛋白质工程及植物基因工程国家重点实验室筹建于 1987 年, 1990 年通过验收, 由生物化学家张龙翔教授任学术委员会主任 ,生物物理学家顾孝诚教授任实验室主任 。1994 年 4月换届时,经国家教委批准 ,由陈章良教授兼任实验室主任,朱玉贤教授任副主任 ,顾孝诚教授任 学术委员会主任。根据国家建设和经济发展的需要,本室立足于国际学科发展的前沿,开展大分子结构与功能关系和分子生物学及基因表达调控的基础理论和应用基础研究, 将现代生物工程新技术、 新方法应用于农业和医药生产 。现共承担“863”高科技项目 7项

2、,“八五”攻关项目 2 项,自然科学基金项目 11项。实验室拥有包括 DNA 自动序列分析仪、 氨基酸序列分析仪、DNA 合成仪及基因转化、 SGI 工作站计算机模拟等在内的一系列现代实验仪器和实验手段。自建室以来,我们已在多个领域中取得了较好的成果,先后获国家教委科技进步一等奖 2项,二、 三等奖各 1 项,近年来每年发表科研论文总数超过 50 篇, 其中被 SCI 收录 10 篇左右。首 次从分子水平初步证明 P68核蛋白与细胞生长、 分裂和癌化相关。继 1996年初发表0. 2nm 分辨率斑头雁氧合血红蛋白晶体结构之后 ,又测定了斑头雁高铁水合血红蛋白的 0. 23nm 分辨率晶体结晶。

3、进一步测定和修正了水稻矮缩病毒( RDV) 三维结构,分辨率由26nm 提高到 25nm,看到了核心中的部分有序排列的 RNA。我室对高频再生水稻的分子机制的研究, 证实该突变体完全是由于内源基因突变造成。将为这一类作物的基因工程提供理论依据和实验模式。在水稻矮缩病毒分子生物学及抗病毒基因工程研究中,我们还对S8 编码的一个多肽 P8进行了研究,发现 P8不是像前人推测的那样,是从S8基因内第三个 AUG 起始翻译的,而是后加工产物, 缺少 C 端 60多个氨基酸。但这个 P8是一功能多肽,参与 RDV 外壳的组成。水稻基因组计划研究目前已得 到在水稻花中大量表达与花发育过程有关的新基因( M

4、ADS hox 基因等) 。另外 ,还成功地克隆了编码水稻 - 淀粉酶/胰蛋白酶基因家族中的过敏原基因,将其在 E . coli 中的原核表达产物作功能分析,首次证明该基因表达产物有抑制鳞翅目昆虫生长的作用 。克隆了两个与G2 豌豆短日照不衰老性状相关的基因,为深入进行植物衰老分子机制的研究奠定了基础。生物信息研究中心已建成序列查询系统 RSR和数据库比较系统 TASTA ,可供国内同行使用。建室以来,平均每年都有数十位国外知名大学的专家 、 教授来访或讲学。先后聘请了美国Cornell 大学的吴瑞先生、 Indiana 大学的Allman 先生和 Arabama 大学的罗民先生为我室的兼职教

5、 授。此外,我室研究人员也经常应邀访问国外大学和科研机构 、 参加学术会议或讲学,有效地促进了国际交流,使我室成为国外科学家了解我国基础研究的一个重要窗口。2 主要研究领域2.1 丝氨酸蛋白酶及胰岛素的研究在丝氨酸蛋白酶的研究中开展了三方面的工作:( 1) 鉴于 RGD序列可被血小板细胞膜受体511998 年 2 期 生物技术通报 识别,正在对胰蛋白酶分子表面非保守的环区进行这一序列的插入或置换, 使其不仅能与纤维蛋白原竞争结合血小板受体,达到抗栓的目的, 同时, 也能在血栓周围发挥其溶血作用; ( 2) 用噬体展示技术,构建随机六肽的基因文库,通过对特定蛋白酶( 如凝血酶 ,纤溶酶) 的亲和

6、筛选 ,以期得 到该酶的抑制剂,用于治疗心血管疾病 ;( 3) 继续进行如二硫键的改造 、 底物专一性的改造等胰蛋白酶的蛋白质工程研究。胰岛素的蛋白质工程研究 ,主要进行了如下两方面的工作: ( 1) 胰岛素 A 链链内二硫键重要性的研究; ( 2) 胰岛素A 链C 端重要性的研究 。采用 PCR技术对 A 链C 端A19 及A21 做饱和随 机突变,以系统地探讨这两个氨基酸残基的生物学意义和A 链链内二硫键的重要性。2.2 神经生长因子B50 蛋白的研究B50 蛋白是近年来国外研究较多的一种神经生长相关蛋白 ,有证据表明 B50 的表达很可能 是神经系统轴突生长及突触形成的必要条件之一,我们

7、采用单侧迷路损坏的方法建立大鼠前庭代偿的动物模型,利用 DIG 标记的大鼠B50 cDNA 为探针,用原位杂交方法检测B50 mRNA水平时程变化。实验表明,正常动物脑内海马区 B50 基因高水平转录,并损毁边路后在前庭核区, 下橄榄核团内 B50 mRNA 水平有明显增高的趋势。此工作仍在进行,期望在基因转录水平上观测 和了解前庭代偿及脑损伤修复的机理 。2.3 P68 核蛋白的研究P68 是一个与细胞生长密切相关的蛋白,具有很高的保守性 ,依赖于 RNA 的 ATPase 活性及解旋酶活性,与 SV40的 T 抗原有免疫交叉反应。我们已从人胚盘 cDNA 基因库中分离得到 P68 完整基因

8、,克隆后测得全 cDNA 序列 2287碱基 ,编码614 氨基酸,与国外文献相比 ,3 端长100 多碱基,3 端非编码区有两个碱基不一致。今后将在 E . coli 及昆虫杆状病毒中表达, 制备抗体, 并在培养细胞中研究 P68 与其它有关蛋白( p53,p105RB) 的相互作用及结构与解旋酶功能关系。 2.4 溶栓药物研究尿激酶原是有潜在应用前景的溶栓剂 。我们在获得Pro -UK cDNA 基因的基础上,已在 E .coli 系统、 昆虫杆状病毒系统以及 CHO 系统得到 了表达 。其中在家蚕杆状系统中表达量为每ml 家蚕淋巴液 30 g。Pro -UK 经硫铵沉淀及免疫亲和分离,得

9、到纯化的 Pro -UK。样品还原 后,走SDS - PAGE 电泳可得单一条带 ,分子量为 50kDa 左右, 比活可达 100000IU/mg ,在杆状病毒系统中表达量更高,每 ml 昆虫细胞( sf9) 培养液中 ,用溶纤平板法测得平均活性为 1600IU。免疫亲和层析后纯化样品比活达 60000IU/mg , 纯化回收率为 70%,为国内首创, 达到国际先进水 平。为了提高Pro -UK 与纤维蛋白的亲和力,以及延长其在血液中的半衰期,我们得到了尿激酶原 Leu144- Gly408片段与 tpA Ser1- Ser262 片段杂合体以及抗 PA1-1抑制剂的Pro-UK 突变体,并已

10、在CHO 细胞中得到表达,前者最高表达活性48 小时,无血清培养达80IU/ml。纯化蛋白质在电泳上呈一条带,现正进一步在昆虫系统中扩大表达培养和制备, 并进一步构建其它 Pro - UK突变体或杂合体。2.5 金属硫蛋白研究金属硫蛋白( MT) 是一类低分子量、 富含半胱氨酸的金属结合蛋白,由 和 两个结构域组 成,前者易结合 Zn和 Cu,后者易结合Cd和 Hg 。我们用适当的小肽片段,将人肝金属硫蛋白的结构域基因连接成长度不同的多倍体基因,其中 12倍体基因导入矮牵牛和烟草 ,均获得表达, 成为高Cd结合容量的植株,抗 Cd 能力比对照植物提高 5 10 倍。水稻的转基因工程和在植物的5

11、2 生物技术通报 1998 年 2 期根或绿色组织中特异性表达的研究正在进行中 。这项研究可能在环境保护,去除金属污染方面有应用价值 。2.6 分子生物信息研究 与EMBnet 合作 ,将 EMBnet 引入中国在 CERNET 北大网络节点上构建了核酸和蛋白质序列数据库,建成了序列查询系统 SRS 和数据库比较搜索系统 FASTA ,可供国内同行使用。与德国GBF 合作,将TRANSFAC 数据库引入中国在CERNET 北大节点上构建镜象 ,可供国内同行使用。 虎纹捕鸟蛛毒素的蛋白质工程研究,已搜索并分析比较了以三桥三片为核心模式的小分子多肽的序列 、 结构、 功能信息 ,提出了分子设计和改

12、造的方案。2.7 生物大分子三维结构与功能的关系研究 研究主要以 X- 射线晶体结构分析方法和冷冻电镜术计算机三维重构方法为手段测定蛋白质和病毒等生物大分子及它们的组装物的三维结构 ,研究其结构与功能的关系,用 X- 射线晶体结构分析方法,继1996 年初发表了0. 2nm 分辨率斑头雁氧合血红蛋白晶体结构之后,又测定了斑头雁高铁水合血红蛋白的0. 23nm 分辨率晶体结构,并对其低氧压呼吸的适应性机理进行了进 一步探讨; 完成了斑头雁脱氧血红蛋白的晶体生长和晶胞参数及空间群的测定; 得到了北京鸭氧合血红蛋白的晶体和测定了晶胞参数和空间群; 测定了胰蛋白-绿豆胰蛋白酶抑制剂复合物的0.28nm

13、 分辨率晶体结构并对分子在晶体中堆积的作用力进行了研究。此外,已开始用同晶置换法研究抗菌多肽 Lcl 的晶体结构 。用冷冻电镜术和计算机三维重枫方法进一步测定和修正了水 稻矮缩病毒( RDV) 三维结构,已将分辨率由26nm 提高到 25nm,初步分析了外壳层和内壳层的主要结构蛋白质的位置和形状,并看到了核心中的部分有序排列的 RNA。2.8 植物细胞衰老的分子生物学研究 采用cDNA 差式分析方法( Representational Difference Analysis-RDA) ,比较赤霉素处理前后G2 豌豆细胞内基因表达的差异。克隆得到与豌豆短日不衰老性状相连锁并受赤霉素诱导表达的PP

14、F - 1 基因。研究发现该基因不仅受赤霉素的正调控。而且具有光周期特异性。只有短日照条件下生长的豌豆才能在开花后迅速积累 PPF 1mRNA。长日照条件下几乎无该基因产物积 累。赤霉素与植物个体有序衰老的关系虽然尚未得到最终证实,但 GA1和 GA3 处理 G2 豌豆顶端生长点能大大延缓其衰老这一实验表明, 它至少影响着个体衰老的进程 。克隆和研究受 GA调控的基因或基因群,有可能成为该研究领域的一个突破口,从而揭开植物个体发育与衰老之 谜。本项研究成果虽然尚未整理发表, 但作者已获得了 PPF -1 基因的全序列并做了一系列Northern杂交和组织形态分析,有足够的证据说明该基因在植物生

15、长发育中的重要地位 。因为PPF - 1 基因有可能是世界上第一个与植物顶芽衰老相关的基因,根据其表达特性和赤霉素对G2 豌豆生长发育的生理作用,我们认为上述发现将为深入研究赤霉素调控的基因表达、 研究植 物个体生长发育衰老的分子机制提供新的可靠依据。2.9 枯草芽孢杆菌 TG26分泌的抗白叶枯病菌小肽的分离、 大肠杆菌中的表达及活性测定从 TG26的马铃薯液体培养中分离出一种分子量为 3kDa 的肽,经 PAGE- SDS 电泳分析以 及生物自显影分析推断它是由其它成份转变而来 ,其中高温( 80 ) 能促进该肽的富集,经氨基酸组成分析,它与另一种枯草芽孢杆菌 A014中分泌的小肽 LCI

16、有相同的氨基酸组成。由枯草芽孢杆菌A014 分泌的抗白叶枯菌的多肽 LCI 基因在 E . coli DH5 中 ,以 pBV220 为531998 年 2 期 生物技术通报 载体时高效表达( 占总蛋白 8. 7% ) ,该产物经一系列分离纯化后,分析它的氨基酸组成,结果与其基因序列相符合,对白叶枯菌的有效抑制浓度为 0. 05mg/ml。2.10 水稻矮缩病毒分子生物学及抗病基因工程研究 成功地完成了 RDV 12 条双链 RNA 的分离,cDNA合成及分子克隆工作,完成了 25000 多个碱基对的测定。在原核细胞中表达了 S6、 S7、S8、S9、S10 和 S11, 证明 S11 基因产物是单双链RNA 和 DNA 结合蛋白。将 RDV S2、 S6、 S7、 S8和 S9 分别克隆到结构表达载体 pE3 和 p208 中,转化水稻,已分别获得转化阳性植株。S8 基因转化水稻正在进行抗病性分析,文