《各类研究用显微镜.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《各类研究用显微镜.ppt（72页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第四章 各类研究用显微镜显微镜的基本构造主开关电压指示灯光强预置按钮滤色镜按钮汞灯中心 调节钮X轴Y轴旋钮物镜转盘三目观察筒立体转盘聚光镜孔径光阑调节环视场光阑调节环光强调节钮调焦旋钮张 力调节环屈光度 调节环显微镜的照明法透射式照明(一)中心照明临界照明柯勒照明Khler (二)斜射照明明场斜射照明暗场斜射照明落射式照明 又称“反射式照明”落射式荧光体视显微镜柯勒照明柯勒照明: : 灯丝象成象于孔径光栏和物镜后焦面灯丝象成象于孔径光栏和物镜后焦面, ,标本处照明均匀标本处照明均匀光源光源 视场光栏视场光栏 孔径光栏孔径光栏 聚光镜聚光镜 标本标本 物镜物镜临界照明临界照明: : 灯丝象成象于
2、标本处灯丝象成象于标本处, ,局部明亮局部明亮, ,标本处照明不均匀标本处照明不均匀柯勒照明与临界照明显微镜的种类明场观察法明场观察法暗场观察法暗场观察法相差观察法相差观察法偏光观察法偏光观察法微分干涉观察法微分干涉观察法(DIC)(DIC) 霍夫曼相差观察法霍夫曼相差观察法(RC)(RC)荧光观察法荧光观察法 明场明场/ /荧光荧光: : 通过对标本染色进行观察通过对标本染色进行观察 相差相差/ /微分干涉微分干涉/ /偏光偏光/ /暗场暗场/ /浮雕浮雕: : 把光的相位差转化为明暗和颜色把光的相位差转化为明暗和颜色明场观察法暗场显微镜n暗场显微镜其实质是暗场照明法，即观察时 不直接观察照
3、明光线，而是观察被检物 的反射或衍射光线。因此，视场成为暗 背景，被检物呈明亮的象。依据的原理 是丁达尔现象。暗场显微镜原理n生物学上应用的是透射式照明的一种斜射照明法, 又称超显微镜术n根据丁道尔Tyndall现象(微尘细粒在强光直射下, 不为人眼所见)设计而出n观察到的是被检物体反射或衍射的光线暗场显微镜n暗场显微镜暗场显微镜的结构与明场显微镜基本 相同，采用的聚光镜是暗场聚光镜。其特 点是改变照明光束的路径，使之斜射投向 被检物体。被被检物表面反射或衍射进入 物镜。暗场显微镜n透射式暗场显微镜光路图n被检物表面的绕射光成象暗场显微镜落射式暗场显微镜光路图通过物镜外周照明被检物暗场显微镜原
4、理暗 场 聚 光 镜暗场显微镜原理暗场聚光镜暗场聚光镜暗场显微镜n暗场显微镜的特点：只能观察物体的外部形态及运动。分辨率高，约为0.02-0.004微米。暗场显微镜n物镜镜选择 虹彩光阑物镜n光轴调节1聚光镜的上透镜上加香柏油放置切片，上升 聚光镜，油与玻片接触。2缩小视场光阑，调整聚光镜的高度，使视场 光阑清晰。3居中视场光阑。暗场显微镜暗场显微镜暗场观察法暗场显微镜使用注意事项 使用遮光罩 清洁光学部件 使用厚度小于1.4毫米的玻片相差显微镜n振幅和人眼分辨力人眼分辨物体的颜色和明暗取决 于光的波长和振幅。相差显微镜原理n根据1935年荷兰学者泽尼克(Zernike)提出的相衬法原理 设计
5、n利用干涉现象将人眼不可分辨的相位差变为可分辨的振幅差n环状缝隙（预定式、可调式）和相位面（物镜）相差显微镜n相位及相位差相位：光波通过光学均匀体时，单位时间内 波动所能达到的位置，称为相位。相位差：两束光波在相同单位时间内，所能 达到的位置之差，称为相位差。相差显微镜相物体：只改变入射波相位而不改变入 射波振幅的物体。这种物体的光学厚度是不 均匀的，但不吸收入射光。相差显微镜是利用被检物的光程之差进 行镜检的方法，即将人眼不可分辨的相位差 转变为可辨的振幅差。相差显微镜相差显微镜n相衬显微镜的装置1、环状光阑 2、相板 3、中心合轴望远镜相差显微镜n环状光阑：由大小不同的环形光阑 装在圆盘内
6、。在聚光镜下方并与之 组合形成相衬聚光镜。相差显微镜相差显微镜相差显微镜相差显微镜相板装在物镜的后焦点平面处。相板通过镀在其表面不同的膜来改变光线 的相位和振幅。吸收膜是铬、银等金属镀成的 薄膜，主要吸收光减弱其振幅；相位膜为氟化 镁膜，推迟光线的相位。相差显微镜n相板：由两部分组成，通过直射光的半透明的环状 共轭面；通过衍射光的补偿面。相差显微镜n中心调正望远镜：用以调正环状 光阑所造成的象与相板共轭面完 全吻合。实质是放大镜，放大环状光 阑的象。相差显微镜n相衬镜检原理光源只能通过环状光 阑透明环；通过被检物 时，光线发生不同程度 的衍射；相板使衍射光 和未衍射的直射光产生 相位差和振幅差
7、；经过 后透镜，直射光和衍射 光产生干涉，变相位差 为振幅差。相差显微镜n相差显微镜的正负相衬负相衬：相板的共轭面既镀有吸收膜，又镀有 相位膜，除了减小直射光的振幅外，也推迟其相位 ，与衍射光的相位一致，最终合成波为直射波与衍 射波的振幅和，从而使小粒子的象更明亮，形成暗 中之明（明反差）。相衬显微镜正相衬：相板的共轭面镀有吸收膜，补偿面 镀有相位膜，直射光的振幅减少相位未推迟；衍 射光的相位则推迟，与直射光相差1/2波长，合成 波的振幅为两波的振幅差，小粒子的象暗于背景 ，形成明中之暗（暗反差）。正负相衬波形图n尽量使用亮光源。n使用专用物镜n利用绿色滤光镜镜检n切片厚度在5-10个微米为宜
8、n使用标准的玻片和盖玻片，封片剂要均匀 使用注意事项相差观察法人 胎 儿 成 纤 维 细 胞偏光显微镜n光的偏振现象自然光在垂直光波传导轴上具有许多振动 面且各平面上的振幅相同、频率相同；自 然光经反射、折射、双折射及吸收等作用 成为只在一个方向上振动的光波，为偏振 光。偏光显微镜光的偏振偏光显微镜n单折射物体与双折射物体单折射物体：光线通过物体时，光的性质 和光路不因照射方向而改变，这种物体为单折 射物体。双折射物体：光线通过物体时，光的速度 、折射率、吸收性和光波的振动面、振幅等因 照射方向而有不同，该物体在光学性质具有各 向异性，为双折射物体。偏光显微镜偏光显微镜原理n利用将普通光改变为
9、偏振光进行镜检的方法 ,鉴别物质是否为各向同性(单折射性)n起偏镜与检偏镜、物镜、目镜、载物台偏光显微镜n偏光显微镜是鉴定物质细微结构光学性质的 显微镜。利用偏光装置将普通光改变 为偏振光对具有物体进行镜检。适用于观察矿物、化学及生物学 领域中具有双折射性的物体。偏光显微镜n偏光的产生与作用偏振镜：使通过的普通光成为 在一条直线上振动的偏振光， 用硫酸碘喹啉晶体制成。偏光显微镜偏光显微镜偏光显微镜有两个偏振镜，光源与被检物之间 的为起偏镜；物镜与目镜之间为检偏镜。平行检偏位：起偏镜与检偏镜振动方向平行。正交检偏位：起偏镜与检偏镜振动方向垂直。使用偏光显微镜镜检时，使起偏镜与检偏镜 处于正交检偏
10、位。偏光显微镜n正交检偏位下的双折射体：在正交检偏位下的视场中观察不到单折射 体的被检物；若被检物中有双折射体，则可观 察到其发出的光。双折射体在正交检偏位下，旋转载物台， 双折射体的象在360度的旋转中， 会有四次明 暗变化，每90度一次。变暗的位置为“消光位 置”，从消光位置旋转45度，被检物最亮，称 其为“对角位置”偏光显微镜偏光显微镜n干涉色：正交检偏位下镜检时会看到颜色，这主要 是干涉造成。偏光显微镜偏光镜检术的装置n光源：最好用单色光n载物台：圆形，并可调节中心能 旋转，边缘有刻度n物镜：无应变消色差物镜n目镜：带有十字丝n聚光镜：摇出式聚光镜n伯特兰透镜：在检偏镜与目镜之 间，放
11、大中间象n补偿片：用于精细镜检偏光显微镜n偏光镜检术的方式 1 正象镜检：无畸变镜检，不使用伯特兰透 镜，用低倍物镜，为使照明NA值变小，推 开聚光镜的上透镜。 2 锥光镜检：干涉象镜检，使用高倍物镜， 利用被检物产生的干涉，以伯特兰透镜在 后焦点上形成的干涉象成象，并放大。为 增大NA值，旋入顶镜。偏光镜检光路图偏光显微镜n镜检要求1 镜检时，保证载物台通光孔中心与光 轴一致。2 使起偏镜的振动方向与目镜十字丝的 横线一致，检偏镜的振动方向与目镜十 字丝的纵线一致。3 制片不宜过薄。偏光显微镜偏光观察法微分干涉显微镜原理n微分干涉显微镜也是基于偏光干涉原理的一种显微镜n能使显微镜的图象呈现出
12、浮雕状的立体感n微分干涉显微镜上都具备偏光装置(起偏镜和检偏镜)n诺曼尔斯基(Nomarski)棱镜或握拉斯顿(Wollaston)棱 镜微分干涉差显微镜n基本原理利用偏光干涉原理的一种 显微镜。从起偏镜出来的 直线偏振光通过具有双折 射性物质的分光束器件（ 渥拉斯顿棱镜、诺马斯基 棱镜）分解为两束互相垂 直的直线偏振光，经聚光 镜折射后射向被检物并且 发生横向位移。两束光通 过物镜后，与第二组分光 器件吻合，由检偏镜发生 干涉。微分干涉显微镜微分干涉显微镜微分干涉显微镜微分干涉显微镜微分干涉差显微镜n镜检步骤1安装微分干涉中间镜筒，即渥拉 斯顿棱镜二及检偏镜，安装微分 干涉聚光镜，即起偏镜和渥拉斯 顿棱镜一。2进行视场光阑的光轴中心调节3调节起偏镜。4选择聚光镜圆盘上与物镜相应的数字位置镜检。5选择背景干涉色，灰色最佳。 微分干涉差显微镜镜检注意事项1微分干涉灵敏度高，制片表面不能有 污物及灰尘。2用圆形载物台为宜。3玻片盖玻片的厚度必须符合标准（超 标会使被检物与视场光阑不能同时成象 ），且无瑕疵。4双折射物体不能达到微分干涉效果。微分干涉差显微镜镜检注意事项5不能达到微分干涉效果时，检查以下各点 ：n起偏镜调节与中间镜筒的方向是否正确n玻片与盖玻片后厚度n有无污染微分干涉观察法微分干涉显微镜微分干涉显微镜霍夫曼相差观察方法
