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1、?*国家自然科学基金资助项目( 30171178)大鼠溃疡性结肠炎相关基因表达谱研究*刘慧荣 ? 张 ? 卫谢建群? 吴焕淦 ? 黄建锋? ? 刘 ? 敏? ? 张琳珊( 上海市针灸经络研究所免疫室, 上海? 200030;?上海中医药大学附属龙华医院消化科, 上海? 200032;? ?上海博星基因芯片有限责任公司, 上海? 200092)? ? 溃疡性结肠炎(UC)发病涉及免疫系统、 环境、 以及尚未确定的慢性肠道炎症易感基因之间的相互作用, 尚未确切阐明发病机制。国外已有应用基因芯片研究 UC 的相关报道,本课题组从动物实验方面对实验性溃疡性结肠炎大鼠相关基因表达谱进行了研究, 以期探讨
2、溃疡性结肠炎差异基因与其发病的内在机制。材料与方法模型制备 ? 由上海中医药大学实验动物中心提供的雄性 SD 大鼠共 30 只, 体重(140? 20) g, 随机分为造模组( 20只)、 正常组(10 只) 。采用溃疡性结肠炎患者术后新鲜结肠粘膜, 加适量生理盐水制成粘膜匀浆, 冷冻 24 h, 溶冻后 3 000 r/ min 离心 30min, 取上清液提纯测定蛋白质含量, 并与 Freund 佐剂混合配成乳剂。模型组大鼠首次每只足趾内注射抗原 3 mg, 并在10、 17、 24 和 31 d 分别于足趾、 背部、 腹股沟、 腹腔内注射抗原 6 mg( 末次注射不加 Freund 佐剂
3、), 至血清抗结肠抗体达到一定效价, 对模型大鼠用 2% 戊巴比妥钠 30 mg/kg 行腹腔麻醉, 用 3% 福尔马林 2 mL 灌肠, 留置 1 h, 以生理盐水洗净后排出, 再用抗原液( 10 mg/ mL 不加佐剂) 2 mL 灌肠, 留置2 h, 洗净排去。造模结束后, 模型组大鼠和正常组大鼠各 10只, 颈椎脱位处死, 剖开腹腔, 割取远端结肠 2 3 cm, 分为两段分别置于 10% 福尔马林与液氮保存备用。结肠粘膜组织病理学观察? 标本常规固定, 石蜡包埋、切片、 HE 染色, 光镜下观察。总 RNA 混合抽提与鉴定? 每组 10 只大鼠结肠标本混合抽提总 RNA, 采用一步法
4、, 用分光光度法检测其含量和纯度, 并通过甲醛变性凝胶电泳观察- 20 ? 时和- 70 ? 保温1 h后总 RNA 28S 和 18S 条带的变化。芯片制备? 大鼠基因表达谱芯片 2 张, 由上海博星基因芯片有限责任公司制备提供。芯片类型: BiostarR- 40s。探针制备 ?参照 Schena 的方 法逆转 录标记 并纯 化mRNA, 于 50 ?L 逆转录反应体系中加入 3 ?g mRNA, 用Cy3 -dUTP 标记正常组结肠组织 mRNA, Cy5 -dUTP 标记模型组结肠组织 mRNA, 利用 Superscript?逆转录酶合成探针,乙醇沉淀后将 Cy3 -dUT P 和
5、Cy5dUTP 标记的探针混合溶解在20 ?L 5? SSC+ 0. 2% SDS 杂交液中。杂交与洗涤? 将芯片和杂交探针分别于 95 ? 变性后置于杂交舱内, 加入混合探针, 用杂交密封舱加以密闭。42 ?杂交箱内杂交 18 h 后, 洗片试剂 1, 2, 3, 洗涤 10 min, 洗涤液1 冲洗玻片, 晾干。重复 1 次。芯片检测与扫描分析 ? 用 ScanArray4000 扫描芯片, 应用 GenePix Pro 3. 0 图像处理软件分析 Cy3、 Cy5 两种荧光信号的强度和比值。取两次芯片结果 Ratio 均 2. 0 或 Ratio均 2) , 表达降低的基因 96 条(
6、Ratio 值 0. 5) 。2 次杂交平均 Ratio 值最高达 315. 606, 最低为 0. 189。差异表达基因生物信息学分析与归类? 对所筛选到的基因 269 条中已知的 90 条基因进行分析, 包括: 细胞骨架运动、蛋白水解酶、 免疫、 炎症、 感染、 代谢、 细胞外基质成分、 肿瘤、信号传导、 细胞周期调控相关基因等多种生命活动相关基因。讨? ? 论溃疡性结肠炎的发病涉及诸多基因, 但在基因表达调控、 机体免疫及细胞分化等重要生命活动中都并非每个基因单独发挥作用, 众多基因是作为一个统一的整体对机体进行调节, 发挥作用的。自 1995 年第一篇基因表达谱芯片文章以来, 基因芯片
7、已被广泛应用。国外一些学者 1 5对溃疡性结肠炎患者的基因表达谱进行了研究, 并取得部分成果, 国内尚未见相关报道。本研究采用了比较成熟的动物模型, 进行相关探讨,得到的部分差异基因与国外学者研究一致。如 Lawrance IC等 5的研究显示钙结合蛋白 S100 基因过度表达, 在本项研究中, S100A9 表达增高倍数为 157. 135; von Lampe B等 6研究显示 UC 患者 活检组 织基质金 属蛋白 酶抑 制因子 1mRNA 在炎症组织中表达显著增加, 本研究中表达增高 3.683 倍。(下转第 581 页)570?复旦学报( 医学版) Fudan UnivJ Med Sc
8、i2004 Nov, 31(6)图 2? 菌株 Z12不同发酵阶段菌丝的形态Fig 2? Picture of Z12mycelium at different stagesA: Stage of seed; B: Stage of per -fermentation ( 24 -48 h) ; C:Stage of mid - fermentation( 96 - 120 h) ; D: Stage of post -fermentation ( 144 -216 h)讨 ? ? ? 论本研究经紫外和 NTG 联合诱变产生的高产菌 Z12经传 4 代产生那西肽稳定, 最高发酵单位达1 510
9、 ?g/ mL, 与出发菌种 Z10发酵单位( 950 ?g/mL) 相比发酵单位提高达 58. 9%。该菌种提交杭州汇能生物技术公司进行 30 吨发酵罐生产, 发酵单位达到2 300 ? g/ mL, 比出发菌种发酵单位提高76. 9%。这是由于发酵罐的溶氧、 补料等条件均优于摇瓶, 因此发酵单位高。Z12菌种在摇瓶发酵中的生化曲线和各阶段菌丝形态显示, 菌体在种子生长阶段, 生长旺盛, 菌丝粗壮成网状; 在发酵前期, 葡萄糖快速消耗, pH 值 下降, 菌体大量繁殖; 发酵中期菌丝成网且形成菌核, 那西肽迅速产生; 至发酵后期, 菌体和菌丝自溶。这一过程符合抗生素发酵一般规律。但那西肽 产
10、生菌 S. actuosus发酵自身特点是在发酵中产生明显的菌核。本研究观察到 Z12菌种所需要氮源比原来培养基含量高。研究结果表明在原有培养基的基础上增 加 2% 黄豆粉, 0. 01% 硫酸锰可以提高产量。之所以增加黄豆粉可以提高发酵单位, 其原因是高产菌株对氮源的需求量增大, 增加氮源可以满足菌种生长需要。参? 考? 文? 献1? 河合宏. ? ! # J . Feeding, 1988, 28( 4) : 572? 王付转. 诱变和筛选方法在微生物育种中的应用. 洛阳师范学院学报, 2002, 10( 2) : 953? 周, 李继杨. 那西肽突变生物合成的研究. 中国抗生素杂志,19
11、95, 20( 3) : 1594? 周. 分光光度法在那西肽工业生产中的应用. 中国医药工业杂志, 1999, 30( 12) : 5485? 周, 姜雅芬. 那西肽产生菌 S. actuosus 的诱变. 上海医科大学学报, 1991, 18( 2) : 133( 收稿日期: 2004- 01- 14) ( 编辑: 张世功)( 上接第 570 页)? ? 对溃疡性结肠炎基因表达谱的探讨, 虽然证实了许多相关基因表达异常, 但尚未发现特异性易感基因。同时, 大鼠芯片与人表达谱芯片相比还不够成熟, 部分已知基因虽与人相应基因类似, 但功能上的差异尚不清楚, 且大鼠基因功能研究较少, 尤其许多未
12、知基因片段, 还有待今后芯片技术和基因功能的完善中深入分析本研究结果所包含的有意义的信息。?关键词? ? 溃疡性结肠炎; ? 大鼠; ? 基因表达谱?中国图书馆分类法分类号? ? R 754. 62参? 考? 文? 献1 ?Dieckgraefe BK, Stenson WF, Korzenik JR, et al . Analysis ofmucosal gene expression in inflammatory bowel disease by paralleloligonucleotide arrays. Physiol Genomics, 2000, 4( 1) : 12 ? Di
13、eckgraefe BK, Crimmins DL, Landt V, et al . Ex pression of theregenerating gene family in inflammatory bowel disease mucosa: RegIalphaupregulation, processing, andantiapoptoticactivity. JInvestig Med, 2002; 50( 6) : 4213? Uthoff SM, Eichenberger MR, Lewis RK, et al . Identification ofcandidate genes
14、 in ulcerative colitis and Crohn? s disease using cDNAarray technology. Int J Oncol, 2001, 19( 4) : 8034? Nakajima A, Wada K, Katayama K, et al. Gene ex pression profileafterperoxisomeproliferatoractivatorreceptor -gammaligandadministration in dextran sodium sulfate mice. J Gastroenterol ,2002, 37(
15、Suppl 14) : 625 ?Lawrance IC, Fiocchi C, Chakravarti S. Ulcerative colitis andCrohn? s disease: distinctive gene expression profiles and novelsusceptibility candidate genes. Hum Mol Genet, 2001, 10( 5) :4456? von Lampe B, Barthel B, Coupland SE, et al. Differential expressionof matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors in colonmucosa of patients with inflammatory bowel disease. Gut, 2000, 47( 1) : 63( 收稿日期: 2004- 06- 24) ( 编辑: 刘忠英)581? 万? 睿, 等. 那西肽产生菌 S. actuosus 选育及发酵条件的优化
