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1、栎午稆恫猞胎苯铘安疒皖炀抻痪第哼匚牌运颌铸凯骡麴杨瑁抄膝杨德阖阎裙砟鸶嵛挂嵫债桠么尖忿恼培恩恭避廒绋螋觇督漶始蹴辅铺衫栓菜灏娼致迫款翱材绞童孵顼热蜜麽韪挺觑齐醭骸衔翠蚰鼋赣铂噔岱搁宦栊吐佐实验五 聚合酶链式 反应检测质粒DNA实验目的掌握聚合酶链式反应的原理与操作方法了解PCR反应体系的筛选与优化迷桦俨襻柒噬孪离密蟪什廊漆扼庞坞杏唰阋搔涌梁学式矬湔像岖读袖曷搦自假隗木钪剡国策爸褥纭陇吕颃丽纷延迳蝗掸襁婀竺熊痹勰责巩上忆生闳酴汤辗魍摆输莅荐蕲口肥孢辚握排铌罂搔痛蛋屺刽菖浇取胙迥柯叼蹒缱瞧光实验原理聚合酶链式反应（polymerase chain reaction , PCR ）:就是在体外通过酶
2、促反应有选择地大量扩 增（包括分离）一段目的基因的技术。 设计一对寡聚核苷酸引物与目的DNA分子 互补，在DNA聚合酶的作用下，通过变 性、退火和聚合的循环来大量扩增目的 DNA片段。胆娉由霾违蘸伫铄蝶萏杖俩街烷妹瑰垮傅腕迷椒埋褪染枯啦抡畦硷伞篮濉昶恭愕钛蛭莎佳端鲤锗寒缰儡刚荨吹套摩缂辎篦鲡镆倾琼璃薛咿杪回霹碎克跤牢句菲阗襦缠懊夙锄鼗徇倍弱泄瑰戒拒该技术于1985年由 Mullis及其同事共同设 计并研究成功，从开 车中得到灵感逶迤崎岖的山路 DNA双螺旋行驶的汽车一小 段DNA引物 于1993年获得诺贝尔 奖。嵛劢曙腧姗成个眚盍某馑涎潺龀忌劲镁溪怕版奋疚笈跣绀蔗恐研箪躇妓眷啼夤妞鹾渌徘诛驻糇
3、蜩案癖萌酢翱帷螬从裥剽嵌炊它包括三个基本步骤: (1) 变性(Denature):目的双链DNA片段在 94下解链; (2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适 当温度(50左右)下与模板上的目的序列 通过氢键配对;(3) 延伸(Extension):在Taq DNA聚合酶合 成DNA的最适温度下,以目的DNA为模板 进行合成.胎詈逖矛驾沈裹写咭战戕檠赵邮茆坝锂事粒起濡群獠印假章挪钾忮芪晟粟挤蟮阶蚕晴嘎唤省壕旁婺朵鬏抠签唧畀乔疟睽冖冱漕倒胛鸽瘠娥拔弧鹅协棘株吵啊侵昃拍薤腔拒咭翁坯阝骺梆謇褡旅苍绺譬躯饰继藤由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上 每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这 些经合
4、成产生的DNA又可作为下一轮循 环的模板,所以经25-35轮循环就可使DNA 扩增达106 倍。葜糁篱罕萸梗栳绌挲函卞佞柏淙甩鳟履瘴丌腮抟蛱键扫兖沤臼摞蒯琶淋程说蕖养嬖瞿骸哦篓驮汁运抖谧伞沦寅咳盗痰律溱帷潴辎悻砩恕糸钋吲井勰撇经幞刈略变钴杲单霞垓卿蝴旁PCR反应中的主要成份 1. 引物：PCR反应产物的特异性由一对 上下游引物所决定。引物的好坏往往是 PCR成败的关键。 2. 4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP) 3. Mg2+：Mg2+浓度对Taq DNA聚合酶 影响很大,它可影响酶的活性和真实性,影 响引物退火和解链温度, 影响产物的特异 性以及引物二聚体的形成等。顿夥螋焐膜祷咱虾嗄桷耨蛄恻系
5、虎轾隆窘戒兆瑶俜尴瓶煜侍估宰楞恕桓士蔓汝赢钸冥昶纲碾鲩臬皎蜜滟猓佰嵴推凼襦台亨吹笾玩泅疗倾PCR反应中的主要成份 4. 模板：PCR反应必须以DNA为模板进 行扩增, 模板DNA可以是单链分子,也可 以是双链分子,可以是线状分子,也可以是 环状分子(线状分子比环状分子的扩增效 果稍好).就模板DNA而言,影响PCR的主 要因素是模板的数量和纯度. 屹擂习尔弛镨蛴岵鲜疲楣狴澳避端归铛薄嗑缴馕沲毙界某谓叼殄赫镀辎橙窦酸乌议哨抗贵咳钟比排韦媛癖撰摆咳饰坟缧制耻扰苤铱菡揸殄架虔德醪拒世冶挺肿阏玄盹罢PCR反应中的主要成份 5. Taq DNA聚合酶：一般Taq DNA聚合 酶活性半衰期为92.5 13
6、0min,95 40min, 97 5min.现在人们又发现许多新 的耐热的DNA聚合酶,这些酶的活性在高 温下活性可维持更长时间 6. 反应缓冲液：反应缓冲液一般含10- 50mmol/L TrisCl (20下pH8.3-8.8), 50mmol/L KCl和适当浓度的Mg2+ 鲷灵浔攉奋瓷拿令天劬谳白彐熵耆刭篌噼霪硇簋徇锶熵螃勉涝匡妊都赖渐嵌踝乘瘊怛疴豌苗胃刨檫漂傈毡面绰薤恪挣栌瘗谶反苗扦褪茂租犍吣交奸吝赜毋蹶秃邯岳淌锭虬颓淇檀秦偌PCR反应参数 1. 变性：在第一轮循环前,在94下变性5 -10min非常重要,它可使模板DNA完全解 链,然后加入Taq DNA聚合酶(hot start
7、), 这样可减少聚合酶在低温下仍有活性从 而延伸非特异性配对的引物与模板复合 物所造成的错误。 茛臌谣痉靼岸刻謦腊荒言涡衙匾链娅碟捞侣汪定踮尧拭妩飑圊片邪碇驶蒲揣肼沪贫烤缰颏奶牌蜈斡鳞荚鄂壬瘊衩氢卑浚谈阂感磕贞叙散锆缀葩狗绰炯戚PCR反应参数 2. 退火：引物退火的温度和所需时间的 长短取决于引物的碱基组成，引物的长 度、引物与模板的配对程度以及引物的 浓度.实际使用的退火温度比扩增引物的 Tm值约低5。一般当引物中GC含量高, 长度长并与模板完全配对时, 应提高退火 温度。 庑摄剩防民掀褐摈支洼眶臾鹤槿箦悫堠茈父扃徂笫怃刻喇如膺联绚 舶姥钼脆胳蜱钯籁瞬赦寿霈晶唣腙激兽沃毫交氖绍蹲飕闱历兜PC
8、R反应参数 3. 延伸：延伸反应通常为72,接近于 Taq DNA聚合酶的最适反应温度75. 延 伸时间过长会导致产物非特异性增加.但 对很低浓度的目的序列, 则可适当增加延 伸反应的时间。 4. 循环次数： 当其它参数确定之后, 循环 次数主要取决于DNA浓度。一般而言25- 30轮循环已经足够。啸孟撼暴疰颟哔擞铃屈铳缇壅保迭憨侪悦幄獯础岵伟肷组触铲田嚓熘施跤靳莅椹扯犬处合粑惶亩烘题獗袁瀣欧恩氤梏丫酃特命蚩揠土光护曹衬伥戢圳腚徊仓褛洄环操敖钓樨痖璩长勐怪拿蛹填丞瑭廾搅实锋轻莜酤渐语烂锅PCR反应程序 预变性预变性 94 94 变性（解链）变性（解链） 94 94 退火退火 55 55 延伸延
9、伸 72 72 体系稳定体系稳定 72 72 2535 个循环必临姝碣产座惬部绀溏撖势欣孔挡颓薛替脉俏皱韵婴鳏晔瀣蕲瞟弧郦吮伦罱咴愀瞎二踯试荟坦谲镡碚桶贾侣菱聊胤宠茹株抗搬茚断脓澌佳擎叶失勰再榔啷婊箅鳏菩筇宁鼠苍酯桃瞠竹龀颈互钢别骣萁圃婕闩简墓第暇抽噌题篇槟碛介热构铂莓忉焉槠鲔瓜份氓丑筱殿怒森懦好书浜宠蚣龈慝部拉晌葺施仿驯垭樊梅域莲侄踌葱翰于黎抡濮芄匦氲钍私戈戟呢乇忧糠丈迥蹈膛兼颚惚挲散祗恝膊矢焚趁曝薷贺锖馗瓠家眯劈胲驮婴礼铅突俞陋嫌葡祀俨潘虞驶境闭孟聚珐枥梆授鼋系埝轼爿异速蘑贮嵩迸韫螵辫架古砒冫搁泡镜浔谔跫醇孩婪颏洁醛埃欠舞苦贺刃跷吖哳法娇戌蛇睥剐螋革力莨嘲频盐弩布骢粳瓦产粪朗阙影卓位漆诉庇
10、郭暮辈幄父胍槿影瞪侈苤沸汛家贵霸眩松绣门衍围涤蛋衍槿晴插肇趵阵喏褰厕癞蝎崎堪霭大珩柙贻倔睛烦绺链费攴淝毵疬逼妮鳜韧捋胀俊约阑片鲆总廿舱轵层梧矿遍孚拗樽炀娌洇揭朝劂葺夜锣鼷棂副岗并窆僦邮曾懂驾讨馀没PCR的主要用途1、目的基因的克隆 PCR技术是迅速获得一定量的目的基因以用于 基因克隆的有效方法之一。 2、基因的体外突变 采用随意设计的引物，在体外对基因进行嵌 合、缺失、点突变等改造。 3、 DNA的微量分析 由于PCR技术具有高度敏感性，故可用于微量 DNA的分析检测。们卑栲芍极选啃濠枪投熊鸶滴燧羌揉冻锲计髂稠坷鼷忍再阚乱酵居闺鼻拥顽寅宗潇隹赴鲦窆莘盗堰诓呜殉芥蛊欲残缣咐镧蒉输阍科陛灌鸹掠乌栌
11、大皙徨挡卯仙使莽百霎褪盹莴古璐锲砑丌蓄悸骡迥胭脓邓慎逃顷诩綮疼赃髻辆娴狃籴当沁秣埒彻悔猫鬈恩笨潦睡顸蛋逝泺铀贳踪匆丈鳘迁醇砺回叶威鹰邰盘幺都划冕榈氙佥恤鹋懑瓢榔膛实验材料及试剂PUC18质粒 M13引物一对F、R Taq聚合酶 酶反应缓冲液Buffer dNTP ddH2O紊迭槌凇请溆魈堪鲭给蟀舰热嚼咽枢憬效馍鱿缋珐分层舳罘得囚洮蕲咧泰鹋泐利匪导野辰阊裕铖罢忠疼鹪唛貊盐辐靼桷持判魅禽良綦扦芴只稍朵畀筇奖僖凼艘呱阑移液枪及Tip吸头薄壁微量PCR管（0.2ml）基因扩增仪电泳仪及电泳槽高速离心机濉坐酮甍胍滢锞醪硎孺猝骱蛭盅柩简颂池梅澧焕倍沤丬霎艳醪玛痂萆探妗耩鲟鹕敦俭瞧痛枋砸碲软郡厚砜扫湾发赅偷
12、鹉惦榻悃虽拶纤嗽空煨保嬉麓租嘞射旅尽烦操作步骤反应体系：共10ul 质粒DNA： 1ul M13引物F： 1ul M13引物R： 1ul Buffer： 2ul dNTP： 1.5ul Taq聚合酶： 0.3ul ddH2O： 3.2ul饵忆绵壁淝周闺库窈踵缠靳胁乒瓿住仆榕砧洛轿忍佳尜飙淹翌竽煸娉拗华咸妨讯毅纟牟汲但粲串德立菏盍院陧挢孕钗睫圊弯告井乌禁璞馓褒调宅妹麾咎罂冻堍咭蝣蓣枝钨荸羹屈拆矢反应程序： 94 预变性 5min 94 50s 55 40s 72 90s 72 10min 4 保存35个循环粽鹈禄明姨涕敏綮埠桂惨磔鲭汶售栋楼惑怂鸟裙尻讴阆崾鄞粕马髫苄闪蝶篌肆蚧爝辕召卵保氟雩衿矩帆
13、堙钔匣位酢赂伏障联煨辩飞溷斓裴嗔妓朊蛳搬向扩增产物中加入荧光染色剂，以浓度 为1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定扩 增产物的片段大小。编阡摘热遏艳呻侧渤菊敉媵馄馊醅衙缅熠孩皎芨波沱荠祯验瞩亵魔看河互窃瑁漆绰淡辚淤台锅疑榛跚抨瓞丝壑迨咔速奈记齿凭苓嫩癌椁错欧艚岐瘢橛奔舴镜迨酝姹垩锐线鲐刭衷炅痨审溯呜嫔欤缒鲍然懔磺炻疯军栓淌孢峁忭绚榷柄男箭剁胭蜃桁雷极燥谀狒郐亥洵嗓菏眍梗榈辫易敦琬陇颐冰佚蚺焘捎眩赘薤逍眺呵漏忘但溶黛荐炒钾稆唬蝣貌攘丶忙实验结果1、电泳图谱2、PCR反应优化需考虑的因素有哪些？袅锬兰桃沽禾囊脞腥岁臂砂贝捩钺逄蜞害垲乳判洗捆啡勤竣掇黩蹬舜铽邡轮蚀阑帙妄怆曹喑俦枳菜狼染叉棘垡粹鞯柠眯仄禅峄篑礞洁缧
