微囊藻毒素-LR对鱼类分子毒性效应的研究

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1、 I华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 摘摘 要要* 随着水体富营养化加剧，藻类所引起的水污染问题己越来越引起人们的关注，蓝藻是目前已知产生毒素最多、对人类健康造成的危害最大的藻类。微囊藻毒素-LR（microcystins-LR，MC-LR）是有毒蓝藻细胞合成的二级代谢产物，是一种细胞内毒素。微囊藻毒素可影响鱼类的胚胎发育和生长，也可引起肝脏、肾脏等内部器官的病理变化，和导致鱼体的氧化损伤等。然而，有关微囊藻毒素对鱼类分子水平上的毒性效应的研究则很少。本研究以斑马鱼和鳙鱼为对象，采用实时荧光定量 PCR、分子克隆和免疫印迹技术在分子

2、水平上揭示了 MC-LR 对鱼类的毒理效应。 本研究中采用人工繁殖的方法收集健康的斑马鱼胚胎，待孵化出膜后，用浓度为 200g/L 和 800g/L MC-LR 溶液浸泡幼鱼进行攻毒实验。在染毒 12h，24h，48h，96h 和 168h 后取样。用实时荧光定量 PCR 方法检测了斑马鱼幼鱼的重组激活基因Rag （Rag1， Rag2） 、 淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶 （LCK） 、 T 细胞受体 （TCR） 、转录因子 GATA1、 锌指纹蛋白 （Ikaros） 和热休克蛋白基因 （HSP90、 HSP70、 HSP60、HSP27）的表达变化。发现 Rag1、 Rag2、 LCK、 T

3、CR、GATA1 和 Ikaros 都有表达上升趋势，特别是在 800g/L MC-LR 处理后，在很多时间点内表达上升明显，与对照组有显著差异（P肝肾肌肉的规律。Xie 等97报道从我国安徽巢湖采得的 8 种鱼的肝、肾、肠、肌肉和血中均检测到不同含量的 MC，并且发现肝和肌肉中 MC 含量在肉食性鱼中最高，其次是在杂食性鱼，最低是在浮游动植物食性和草食性鱼。 1.2.3.3 微囊藻毒素对鱼类的氧化损伤微囊藻毒素对鱼类的氧化损伤 近年来，许多学者研究发现微囊藻毒素可引起机体的氧化损伤，主要表现为活性氧(reactive oxygen species, ROS)浓度和氧化损伤产物脂质过氧化(li

4、pid peroxides, LPO)的显著增加113119，及抗氧化系统中相关分子和酶的变化122123。在正常生理状态下，活性氧的产生和机体抗氧化系统存在着精妙的平衡，当抗氧化系统活性下降或者活性氧产物增加时，即发生氧化损伤120，组织中产生的活性氧被抗氧化系统高效地消除掉。当细胞或组织被毒物侵染后，会发生连续的活性氧(ROS)损伤脂质不饱和脂肪酸(lipid polyunsaturated fatty acids, PUFAs)，而水生动物含有更多的高度不饱和脂肪酸120，因此脂质过氧化对于水生动物而言尤其重要。 Xu 等127对草鱼进行腹腔注射染毒，剂量是 100g MC-LR/kg。

5、染毒 1h 后，检测发现肝脏中的 GSH 的活性较对照组来说降低很多，同时分析发现增加体内 GSH的含量对肝脏有一定的保护作用。Xu 等127还对草鱼做了类似研究，腹腔注射剂量是 900g MC-LR/kg 和 8 mg GSH/kg，于 2h 后，电镜下观察肝脏的超微结构没有变4华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 化，而对照组中没有注射 GSH 的草鱼肝脏的损伤较严重。 1.3 淡水鱼类去毒酶基因在微囊藻毒素去毒方面的重要作用淡水鱼类去毒酶基因在微囊藻毒素去毒方面的重要作用 微囊藻毒素进入机体内会导致大量的活性氧的产生，而活性氧能加

6、速机体的氧化衰老，有严重的危害作用，但生物体内抗氧化系统会徐速启动一系列氧化还原反应以防止机体产生的损伤，从而保护机体的正常生理功能113119。 Pflugmacher 等42于 1998 年分别选取不同途径接触微囊藻毒素的水生动植物，通过同位素标记的方法研究证实，在水生动植物体内 GST 催化微囊藻毒素与 GSH的加合反应。并认为这是微囊藻毒素在生物体内代谢的关键一步，使毒素的毒性降低，水溶性增加，便于通过排泄系统排出体外，因而鱼类等淡水生物 GST 基因也被称为微囊藻毒素去毒酶基因。 胡智泉等47的研究结果表明，在微囊藻毒素的作用下， 细长聚球藻的 GST 活性刚开始时是下降的，但从第

7、2 天又开始上升，并且一直保持在较高水平，他们分析推测 GST 参与了的解毒过程。并将这一现象的分子机理作出了相关解释： (1) 由于 GST 酶蛋白的亚基可以发生磷酸化， 藻毒素抑制蛋白磷酸酶的活性， 所以 sGST 活性的变化可能与其转录后修饰加工有关，即暴露在毒素存在的环境下，GST 蛋白的转录后修饰发生变化； (2) GST 基因在外界环境毒素压力的影响下，转录及表达加强，生成更多的 GST酶蛋白62，从而维持机体的氧化还原平衡状态。 1.4 本研究的目的本研究的目的 由于人类活动造成的污染加重，水体富营养化程度日趋严重，藻类水华在世界范围内频繁爆发，造成野生动物、家畜和人类患病或死亡

8、的情况时有发生2224。淡水水体的微囊藻毒素污染已成为一个世界性的水环境问题，备受关注和重视。目前，微囊藻毒素的产生机制，毒效应机理和健康风险是国内外环境毒理学研究的热点。分子毒性效应是评估环境污染物安全性的重要指标。近年来，分子生物学理论和技术的发展，为开展这方面的研究提供了新的思路和研究工具。 在水生生物方面，微囊藻毒素对鱼类的致毒效应和鱼类对藻毒素的解毒机制是近年来的研究热点，因此，本研究以斑马鱼 Danio rerio 和鳙鱼 Aristichthys nobisli 为研究对象，从分子水平上探讨 MC-LR 对鱼类的免疫毒理效应，阐述鱼类对微囊藻毒5华 中 科 技 大 学 博 士 学

9、 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 素的解毒代谢分子机理，其意义在于：一方面是为微囊藻毒素生态健康风险评价研究提供重要的理论依据；另一方面是进一步提高淡水鱼类抗氧化能力和对微囊藻毒素的分解能力奠定基础。 6华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 2 微囊藻毒素对斑马鱼幼鱼热休克蛋白基因表达的影响微囊藻毒素对斑马鱼幼鱼热休克蛋白基因表达的影响 2.1 前言前言 受到环境应激，生物可合成特定蛋白以防止细胞损伤5486。目前已发现多种环境应激，如污染物、温度、盐度、低氧/缺氧和紫外线暴露等均可诱导产生热休克蛋白 （he

10、at shock proteins, HSPs） 。 根据分子量不同， HSPs 可分为 HSP90， HSP70， HSP60，HSP40 和小分子量的 HSP38。 Chen 等71用三种不同剂量的微囊藻毒素刺激小鼠后，通过检测发现，热休克蛋白的表达分别上升了841.60， 704.47和452.87倍。 Wei等40的研究同样发现， 在MC-LR刺激后鱼类热休克蛋白基因的表达显著增加，特别是类热休克蛋白 70 基因，上升了84.45 倍。热激蛋白是细胞处于应激状态下的重要产物，既然 HSP 在哺乳动物和鱼类中都发现有显著的增加， 这说明热休克蛋白在 MC-LR 诱导的应激反应中起着非常重

11、要的作用40。但微囊藻毒素对斑马鱼幼鱼 HSPs 的研究还未见报道，为了了解微囊藻毒素对斑马鱼幼鱼 HSPs 表达的影响，本研究用荧光定量 PCR 检测了斑马鱼幼鱼在受不同浓度的 MC-LR 刺激后 HSP90，HSP70，HSP60 和 HSP27 的表达变化。 2.2 材料与方法材料与方法 2.2.1 实验材料实验材料 反转录试剂盒 RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit：Fermentas 公司； 胶回收试剂盒（E.Z.N.ATMGel Extraction Kit） ：Omego 公司； DNase I（RNase Free;5U/l） ：

12、Fermentas 公司； Realtime PCR Master Mix （2SYBRGreen Realtime PCR Master Mix） ： TOYOBO公司； TRIzolReagents：Invitrogen 公司； pMD18-T 载体：TA 克隆。TaKaRa 公司； 大肠杆菌（E.coli）DH5 菌株：克隆载体宿主菌，本实验室保存； 实验有关溶液和缓冲液除特别注明外，均参照分子克隆实验指南66所述方法配制。 7华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 2.2.2 实验用鱼实验用鱼 实验用斑马鱼购自湖北省武汉市武汉港花

13、鸟鱼市场，实验前暂养 2 周。斑马鱼平均体重 1.50.2 g，饲养条件为：水温为 260.5，光暗比为 14h：10h，每天投喂颗粒饵料两次， 每 50 尾鱼放于一个鱼池中。 采用人工繁殖方法64收集斑马鱼受精卵。每 20 个受精卵置于一个容积为 250ml 的玻璃培养皿中，待孵化出膜后，每 80 尾幼鱼置于容积为 1.8L 的玻璃培养皿中，采用充分曝气的自然水为培养液，每天换水一次。孵化鱼卵方法见The zebrafish book64。 2.2.3 微囊藻毒素微囊藻毒素-LR 将 MC-LR（纯度95%，Calbiochem，CA，USA）粉末用 DMSO 溶解成 4g/l 的溶液于80

14、冻存，实验前用 0.8%生理盐水稀释成所需浓度。将孵化出膜 1d后的幼鱼进行毒素浸泡实验，实验组 MC-LR 浓度分别为 200g/L 和 800g/L，对照组则用等量的 0.8%的生理盐水，分别在 12h、24h、48h、96h 和 168h 后取样，每个时间点取 60 尾幼鱼，实验重复 3 次。 2.2.4 RNA 的提取的提取 用 Trizol 方法提取斑马鱼幼鱼的总 RNA。步骤如下： （1）冷冻的组织加入 1ml Trizol 放入无 RNase 匀浆器中进行匀浆。匀碎后，转入无 RNase 的离心管中，室温静置 10 min； （2）12000 g，4离心 10 min； （3）

15、取上清于另一个离心管中， 加入 200l 氯仿， 剧烈摇动 15 s， 室温静置 5 min； （4）12000 g，4离心 15 min； （5）再将上清转入到干净的离心管中，加入 500l 异丙醇，轻轻混匀后，室温静置 10 min； （6）10000 g，4离心 10 min； （7）最后将上清倒掉，沉淀用无水乙醇洗涤后在 7500 g，4条件下离心 8 min，所得沉淀放在 100%乙醇中，-80保存备用。具体见 Trizol 试剂操作说明书。 2.2.5 RNA 样品中样品中 DNA 的去除的去除 首先用 20l DEPC 水溶解 RNA，在紫外分光光度计上测出 RNA 样品的浓度，

16、根据所测的浓度， 用 DNase I 进行 DNA 的去除。 基本反应体系如下： 约 12g 总 RNA， 8华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 DNase I（RNase-free）6l， 3l RibolockTM Ribonuclease Inhibitor 和 6l 10DNase I Buffer，加入 DEPC H2O2，使终体积达到 60l。在 37恒温静置 30 min 后，加入 3l的 25mM EDTA，于 65反应 10min。将反应所得的样品进行下一步反转录。 2.2.6 cDNA 模板的制备模板的制备 在上述反应产物中加入 5Reaction Buffer 24l，12l 10 mM dNTP ，6l RibolockTM Ribonuclease Inhibitor