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1、分类号： 密 级：公开 学 号：2009108012 单位代码：10759 石河子大学石河子大学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 【基于代谢组学方法研究棉粕源基于代谢组学方法研究棉粕源 发酵产物的代谢物组分及营养特性规律发酵产物的代谢物组分及营养特性规律 学位申请人 聂聂 存存 喜喜 指 导 教 师 张张 文文 举举 教授教授 申请学位门类级别 农学硕士农学硕士 学 科 、 专 业 名 称 动物营养与饲料科学动物营养与饲料科学 研究方向 饲料资源的开发与利用饲料资源的开发与利用 所在学院 动物科技学院动物科技学院 中国 新疆 石河子 2012 年 5 月II The Study of Me
2、tabolite Components of Fermented Product from Cottonseed Meal and Its Nutritional Characteristics Based on Metabolomic Methods A Dissertation Submitted to Shihezi University In Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of Agriculture By Cun-Xi Nie (Animal Nutrition and Feed Sc
3、ience) Dissertation Supervisor: Prof. Wen-Ju Zhang May，2012 Shihezi, Xinjiang, China石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外 ，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意。 研究生签名： 时间： 年 月 日 使用授权声明 本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文
4、的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文在学校图书馆保存并允许被查阅。有权自行或许可他人将学位论文编入有关数据库提供检索服务。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。 研究生签名： 时间： 年 月 日 导师签名： 时间： 年 月 日 I 摘摘 要要 目的：目的：本论文利用液质联用（LC-MS）技术比较分析了棉粕源发酵饲料代谢产物提取方法， 进而通过代谢组学方法对发酵饲料代谢物及其饲喂肉鸡血浆进行分析， 旨在研究发酵产物的营养特性及其对肉鸡消化代谢的影响， 为动物健康状况的保障和发酵饲料的科学评定与利用等提供理论
5、支撑。 方法：方法：本论文由三个试验组成。试验一：以 ZD-3 热带假丝酵母固体发酵棉粕源产物为研究对象，以液相色谱串联质谱（LC-MS）为分析平台，比较分析了 50%冷甲醇（MeOH） 、酸性甲醇/乙腈/水溶液（AMF）和 50%乙腈（MeCN）3 种提取方法。试验二：采用 LC-MS手段对对照组（CG） 、假丝酵母组（CT） 、酿酒酵母组（SC） 、复合发酵组（CF）4 组的发酵代谢物进行分析，结合偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA）方法对数据进行模式识别，根据模型的变量重要性投影（VIP） 、显著性差异检验结果等寻找小分子差异代谢物。试验三：选用 96 只 45 日龄健康黄羽肉鸡，按照
6、每组体重相近、公母各半的原则分为 CG、CT、SC、CF 4 组，每组 4 个重复，每个重复 6 只鸡。CG 组为空白对照组，在基础日粮中加入 6%基础发酵底物；试验 CT、SC、CF 组分别添加 6%的热带假丝酵母 ZD-3 发酵饲料、酿酒酵母发酵饲料、热带假丝酵母和酿酒酵母复合发酵饲料，进行消化代谢试验，研究不同发酵饲料养分的消化代谢率和鸡血浆生化指标与免疫指标； 此外， 还通过代谢组学方法对不同饲料饲喂鸡的血浆进行分析。 结果：结果： 试验一： AMF、 MeCN 和 MeOH 3 种方法提取产物数量分别为 1831、 1522 和 1262种；提取效率表现为 AMFMeOHMeCN。试
7、验二：不同微生物发酵组代谢产物与对照组相比差异显著，且在 PLS-DA 分析中得到了很好的分离，主要表现在甘露醇、琥珀酸等糖类代谢物；磷酸胆碱、L-肉碱、甘油磷酸、磷脂酰乙醇胺（PE）和磷脂酰胆碱（PC）等脂类代谢物；二肽、三肽、甜菜醛、同型半胱氨酸等蛋白质与氨基酸的代谢物；以及烟酸、阿魏酸、尿嘧啶、乙醇醛等其他途径代谢物。除与脂类代谢有关的甘油磷酸、PE、PC 相对含量显著降低（P1.5) and P (PMeOHMeCN in experiment 1. In experiment 2, metabolites had significant differences in fermenta
8、tion group of different microbial compared with the control group and were separated very good in PLS-DA. It mainly displayed in the metabolites of carbohydrate lipid, protein and amino acid, such as mannitol, succinic acid; phosphocholine, L-carnitine, glycerylpho-sphate, phosphatidylethanolamine (
9、PE), phosphatidylcholine (PC); dipeptide,tripeptide, betaine aldehyde, homocysteine; and more other pathway metabolites like IV niacin, ferulic acid, uracil, glycolaldehyde. Metabolites relative content of small molecules were significantly increased than the control group (P0.05)；digestibility of c
10、alcium incresaed significantly in group CT (P0.05） ；AMF 提取法较 MeOH 而言，磷酸胆碱相对含量显著降低（P0.05） 。MeCN 与 MeOH 相比，亚麻酸、硬脂酸、三肽和烟酸 4 种代谢物相对含量有所提高，其中硬脂酸达到显著水平（P0.05)。 The areas are shown as log(10). The ratios of the average peak areas of a metabolite extracted by different extraction method are shown, the ratio
11、 value more than one means the relative content of metabolites improved and less than one means reduced. In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P0.05). 3 讨论讨论 在代谢物提取中，淬灭过程要防止胞内代谢物的泄露49，淬灭可采取不同的方法44,50，然而就本研究来讲，提取的代谢物既有胞内的也有胞外的，选择的是液氮冷冻淬灭法。 在代谢物提
12、取方法选择上， 目前也没有标准的代谢物提取方法，Maharjan 和 Ferenci53研究了酸、碱、冷甲醇、热甲醇、热乙醇和甲醇-氯仿 6 种提取方法对 E.coli 代谢物谱的影响,结果表明冷甲醇方法得到了更多的代谢物。Rabinowitz 和 Kimball54研究发现乙腈/甲醇/水溶液能使三磷酸根的降解达到最小， 减少高能代谢物的丢失及其向低能衍生物的转化， 从而提高代谢物的提取量，因此，乙腈/甲醇/水溶液是提取代谢物的首选。Tokuoka 等55对米曲霉固态发酵的十一种提取方法进行了比较，结果表明乙腈/水（50:50）在 70水浴 5 min，淬灭和提取效果最佳。考虑到用酸和碱提取产
13、物中能检测到很少的峰且产率很低，主要是因为分析前需要中和酸碱，稀释而影响代谢物的浓度，产生的沉淀很难移除，增加了样品中的盐浓度，在用热乙醇提取中部分丙酮酸、核酸和磷酸糖类遭到破坏53,112等不利的影响，本文选择了酸性甲醇/乙腈/水溶液、甲醇、乙腈三种提取方法进行了分析比较。 代谢组学的兴起为其研究提供了强有力的工具， 然而一种好的提取方法是研究的基础，该方法要求尽可能多的提取代谢产物。发酵饲料提取物中包括发酵底方法 代谢物 AMF MeCN MeOH 峰面积比 P 值 峰面积 峰面积 峰面积 AMF/ MeCN AMF/ MeOH MeCN/ MeOH 亚麻酸 6.57 0.15 6.61
14、0.04 6.51 0.12 1.05 1.14 1.08 0.561 硬脂酸 5.66 0.05 b 6.61 0.15a 5.97 0.27 bc 0.11 0.43 4.01 0.002 阿魏酸 6.31 0.30 6.03 0.41 6.34 0.32 1.63 0.91 0.56 0.524 二肽 6.67 0.07 a 6.33 0.17 c 6.56 0.04 ab 2.10 1.31 0.62 0.023 磷酸胆碱 5.92 0.06 b 6.03 0.17 ab 6.25 0.12 a 0.74 0.46 0.61 0.045 甜菜醛 6.53 0.06 a 6.03 0.1
15、7 c 6.50 0.15 ab 3.43 1.03 0.30 0.001 三肽 6.22 0.18 6.14 0.24 6.08 0.08 1.17 1.46 1.25 0.643 烟酸 7.18 0.18 7.08 0.18 7.04 0.15 1.29 1.42 1.11 0.584 半胱氨酸 7.82 0.08a 6.71 0.19c 7.74 0.24ab 12.33 1.05 0.09 0.001 基于代谢组学方法研究棉粕源发酵产物的代谢物组分及营养特性规律 17 物中的物质和酵母在发酵过程中的代谢产物， 尽管在发酵底物选择了相同批次和产地的原料，发酵条件也进行了严格的控制，但是发酵底物的复杂性也会影响到发酵后产物的提取。研究表明，微生物发酵蛋白饲料能够提高动物的消化率、促进动物生长等优点113，其中发酵过程中产生的氨基酸、脂肪酸、维生素、芳香类物质等代谢物是其主要原因，这些小分子物质也正是研究者所关注的物质，在动物的生长、发育等过程中发挥着重要重要。如：亚麻酸是动物必须脂肪酸，阿魏酸是一种芳香物质，也可作为食品添加剂；微生物分解蛋白质产生的小分子二肽和三肽， 比单一的氨基酸更易吸收， 可促进氨基酸的吸收、 蛋白质合成与沉积、矿物元素的吸收与利用，还
