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1、 生 物 工 程 学 报 Chin J Biotech 2010, September 25; 26(9): 11871198 Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 2010 CJB, All rights reserved. Received: April 30, 2010; Accepted: July 22, 2010 Supported by: National Science Foundation of China (Nos. 20806055, 20875068), National Basic Research Pro
2、gram of China (973 Program) (No. 2007CB707802). Corresponding author: Tao Chen. Tel: +86-22-27406770; E-mail: 国家自然科学基金项目 (Nos. 20806055, 20875068)，国家重点基础研究发展计划 (973 计划) (No. 2007CB707802) 资助。 代谢工程转录组平台技术及其在代谢工程中的应用 史硕博1,2，陈涛1,2，赵学明1,2 1 天津大学 系统生物工程教育部重点实验室，天津 300072 2 爱丁堡大学-天津大学系统生物学与合成生物学联合研究中心，天津
3、 300072 摘 要: 组学技术在系统水平上对细胞代谢进行全面的分析，极大地促进了代谢工程的发展和应用。全基因组水平的转录分析可以使研究者更加精确地评估细胞表型，加深对细胞代谢的理解。而且转录组分析也有助于研究者鉴定菌种改良的目标基因，加速对微生物细胞工厂的合理设计及构建。文中介绍了 3 种主要转录组平台技术的原理，并总结了转录组学在代谢工程领域中应用的最新进展和未来发展趋势。 关键词: 转录组，代谢工程，基因芯片，serial analysis of gene expression (SAGE)，massively parallel signature sequencing (MPSS)，
4、RNA-seq Transcriptome platforms and applications to metabolic engineering Shuobo Shi1,2, Tao Chen1,2, and Xueming Zhao1,2 1 Key Laboratory of Systems Bioengineering, Ministry of Education, Tianjin University, Tianjin 300072, China 2 Edinburg-Tianjin Joint Research Centre for Systems Biology and Synt
5、hetic Biology, Tianjin 300072, China Abstract: Omics technologies have profoundly promoted development and applications of metabolic engineering by analysis of cell metabolism at a system level. Whole genome transcription profiles have provided researchers more rigorous evaluation of cell phenotype
6、and an increased understanding of cellular metabolism. Furthermore, transcriptome analysis can conduce to identification of effective gene targets for strain improvement, and consequently accelerates rational design and construction of microbial cell factories for desired product. In this review, we
7、 briefly introduced the principle of three main platforms of transcriptome, and reviewed the recent applications of the transcriptome to metabolic engineering, finally provided conclusions and future prospects. Keywords: transcriptome, metabolic engineering, microarray, SAGE, MPSS, RNA-seq 近年来，包括基因组
8、、转录组、蛋白质组、代谢组和代谢通量组的各种组学技术在揭示细胞生理活动规律的研究中起着越来越重要的作用1-2。通过组学技术，可以系统评价细胞表型，并根据评价结果进一步设计、修饰和重构细胞，提升代谢工程的合理性和有效性3-4，这就是在后基因组时代所强调采取组学技术指导的代谢工程研究方法， 称之为 “系统代谢工程”5。 1188 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q Chin J Biotech September 25, 2010 Vol.26 No.9 J 在各种组学技术中，转录组学是率先发展起来以及应用最广泛的技术6。细胞的功能是从基因的表达开始的，转录组是指某一时间细胞内所有
9、基因转录而来的 RNA 总称。通过分析转录组，可高通量地获得基因表达的 RNA 水平有关信息， 可以揭示基因表达与一些生命现象之间的内在联系。据此我们可以高通量表征细胞生理活动规律，确定细胞代谢特性，并进而对细胞进行修饰改造7-8。本文介绍了转录组学主要技术平台及其原理，总结和评述了转录组学在代谢工程中的应用及进展。 1 转录组技术平台 为了高通量并行分析基因的表达情况，各种转录组技术平台得到迅速发展，主要包括：基因芯片技术 (Microarray)、基因表达系列分析技术 (Serial analysis of gene expression，SAGE)、大规模平行测序技术 (Massivel
10、y parallel signature sequencing，MPSS)以 及 最 新 提 出 的 RNA 测 序 技 术 (RNA sequencing，RNA-seq)，这些技术的工作流程如图 1所示。图 1 主要转录组技术平台工作流程示意图 Fig. 1 Outline protocols of the main transcriptome platforms. 1.1 基因芯片技术 (Microarray) 在转录组研究中应用最早及最广泛的为基因芯片技术，首先从待检测样品中提取 RNA，并利用荧光标记的核苷酸将其反转录成 cDNA，经过标记的核苷酸序列可与基因芯片特定位点上的探针杂交
11、，经检测杂交信号而获取细胞基因表达信息。基因芯片技术已成为一项非常稳定可信的实验技术，目前公布的大量转录组数据主要是利用基因芯片技术产生的。 为了促进基因芯片数据的交流和比较，2001 年基因芯片表达数据协会 (Microarray gene expression data society) 提出了基因芯片试验的标准方案，即MIAME方案 (Minimal information about a microarray experiment)9； 由美国食品药物管理局 (US food and drug administration，FDA) 领导实施的基因芯片质量控制联盟 (MAQC) 发表的
12、报告显示在不同实验室之间基因芯片技术平台内部的数据具有高度的一致性和重现性10。基因芯片是最早开发出来的高通量转录组检测技术，且成本适中，其对较高表达的基因检测比较准确，数据分析软件较多，整个方法史硕博等: 转录组平台技术及其在代谢工程中的应用 1189 J 较为成熟，主要缺点是对低表达基因检测敏感度不够，前期工作基础要求较高，而且很难检测出融合基因转录、多顺反子转录等异常转录产物。 1.2 基因表达系列分析技术 (SAGE) 与大规模平行测序技术 (MPSS) SAGE 技术是一种基于测序技术、开放式的、快速高效的分析细胞基因表达状态的方法，该技术不需任何基因序列的信息，能够全局性地检测所有
13、基因的表达水平，除了具有显示基因差异表达谱的作用外，还对于那些未知基因特别是那些低拷贝基因的发现起到了巨大的推动作用11。SAGE 技术首先从待检测样品中提取 RNA，并用生物素荧光标记的核苷酸将其反转录成 cDNA，随后用一种被称为锚定酶的限制性内切酶 (Anchoring enzyme) 切割双链 cDNA，将回收得到的 cDNA 片段与不同的接头连接，再用标签酶酶切处理后得到 SAGE 标签，连接 SAGE 标签形成标签二聚体并进行 PCR 扩增，最后锚定酶切除接头序列以形成标签二聚体的多聚体，对其测序可得转录组。 MPSS 技术是对 SAGE 技术的改进，但其原理都是基于短标签测序 (
14、Tag-based sequencing) 的方法。MPSS 技术可获得更长的短标签，因而精度更高；此外，MPSS 技术特有的微球荧光测序可直接高通量读出序列，简化了测序过程12。MPSS 技术首先从待检测样品提取 RNA 并反转录为 cDNA，克隆至带有不同 adaptor 的载体文库中，随后 PCR 扩增带有不同 adaptor 的 cDNA 片段， 在 T4 DNA 聚合酶和 dGTP 的作用下使其转换为单链文库，最后通过杂交将其结合在带有 Anti-adaptor 的微载体上进行测序。 SAGE 技术和 MPSS 技术都需要大量的测序工作，但高通量基因测序仪的迅速发展缓解了这一问题，有
15、力推动了它们的推广与应用。但是这些技术的难度较大，而且涉及酶切、PCR 扩增、克隆等可能会产生碱基偏向性的操作步骤，从而影响转录本的正确识别12。Illumina 公司于 2007 年在 MPSS 技术 的 基 础 上 推 出 新 一 代 测 序 仪 Illumina/Solexa Genome Analyzer，正迅速得到普及。 1.3 RNA 测序技术 (RNA-seq) 新 一 代 高 通 量 基 因 组 测 序 仪 的 迅 速 发 展 (Solexa，454 GS-FLX，SOLiD，tSMS) 不仅给基因组领域带来革命性的突破，同时也给转录组检测方法带来重大革新。采用类似 SAGE 技术和 MPSS 技术的理念，新一代高通量基因组测序仪可以通过测定细胞全部转录产物序列，通过序列比对得到最后的转录组，一个新的测定转录组的“RNA 测序”法出现了， 该技术称为 RNA 测序技术 (RNA-seq)13-14。 RNA 测序技术的原理与 SAGE 技术和 MPSS 技术一致，即对细胞转录产物进行测序，统计测得的每条序列获得每个特定转录本的表达量，可提供精确的数字化表达谱检测。该技术首先将细胞中的所有转录产物反转录为 cDNA 文库，然后将 cDNA 文库中的 DNA 随机剪切为小片段(片段大
