《麻疹病毒载体的优化与改造》由会员分享，可在线阅读，更多相关《麻疹病毒载体的优化与改造（109页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、中国疾病预防控制中心博士学位论文麻疹病毒载体的优化与改造姓名：修梅红申请学位级别：博士专业：免疫学指导教师：李德新20070701中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所博士学位论文缩写B 9 5 8c e l l ：B 9 5 ac e l l ：B p ：e D N A ：C P E ：D A B ：d N T P ：E c o l i ：E G F P ：E L I S A ：H a m R z ：H d v R z ：H P I V ：H R P ：I F A ：I g ：I P r G ：M c A b ：LP r o t e i n ：M o I ： M V ：N C ：N C R ：
2、N D V jN N S V Np r o t e i n ：P F U ：Pp r o t e i n ：R N A ：英文缩略词表A b b r e v i a t i o n s全称E B V - t r a n s f o r m e dm a r m o s e tBe e l ll i n eA d h e r e n ts u b l i n eo f B 9 5 8e e l ll i n eB a s ep a i rC o m p l e m e n t a r yD N AC y t o p a t h i ce f f e c tD i a m i n o b e n
3、z i d i n eD e o x y r i b o n u c l e i ca c i dE s c h e r i c h i ac o l iE n h a n c eg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i nE n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y H a m m e r h e a dr i b o z y m eH e p a t i t i sDv i r u sr i b o z y m eH u m a np a r a i n f l u e n z a
4、v i r u sH o r s e r a d i s hp e r o x i d a s eI m m u n o f l u o r e s e n c ea s s a yI m m u n o 西o b u l i nI s o p r o p y l t h l o B - D g a l a c t o s i d e 一1 3 D M o n o c l o n a la n t i b o d i e sL a r g ep r o t e i nM u l t i p l i c i t yo f i n f e c f i o nM e a s l e sv i r u
5、 sN i t r o c e l l u l o s eN o n c o d i n gr e g i o nN e w c a s t l ed i s e a s ev i r u sN o n s e g m e n t e dN e g a t i v eS t r a n dV i r u sN u c l e o p r o t e i nP l a q u ef o r m i n gu n i tP h o s p h o p r o t e i nR i b o n u c l e i ca c i d中文名称E B 病毒转化绒猴B 淋巴细胞系 细胞系B 9 5 8 的黏
6、附亚细胞系碱基对互补D N A细胞病变效应二氨基联苯胺脱氧核糖三磷酸大肠杆菌绿色荧光蛋白 酶联免疫吸附实验 锤头状核酶序列丁型肝炎核酶序列人副流感病毒辣根过氧化物酶免疫荧光检测免疫球蛋白 异丙基硫代半乳糖苷 单克隆抗体 大蛋白( R N A 依赖R N A 聚合酶蛋白) 感染复数 麻疹病毒硝酸纤维素非编码区新城疫病毒不分节段的单股负链病毒核蛋白空斑形成单位磷酸化蛋白核糖核酸7中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所博士学位论文R T - P C R ：R V ：S e 、tS D S ：S D s p A G E ：T E M E D ：R e v e r s et r a n s c r i p
7、 t a s e -c h a i nr e a c t i o nR a b i e sv i r u sS e n d a iv i r u sS o d i u md o d e c y ls u l f a t ep o l y m e r a s 。逆转录一聚合酶链反应狂犬病毒仙台病毒 十二烷基硫酸钠 s D s - p 0 1 y a c 刚撇i d eg e lS D S 。聚丙烯酰胺凝胶电泳 E l e c t r o p h o r e s i s。N ：，N ，N j ，N 。t r a m 8 h y lN N ，N ，四甲基乙二胺N e t h v l e l l ed
8、 i a m i n e一V e r oc e i l ：A f r i c ag r e e nm o n k e yk i d n e yc e l l sG S ：G E ：E C M VI R E S ：G e l l es t a r tG e l l ee n dE n c e p h a l o m y o c a r d i t i sv i r u s ( E M C V )i n t e r n a lr i b o s o m ee n t r ys e q u e n c e非洲绿猴肾细胞基因起始基因终止 E C M V 病毒内部核糖体进 入位点8学位论文原创性、真实性
9、声明本人郑重声明：麻疹病毒载体的优化与改造是本人在中国疾病预防控制中心免疫学专业攻读博士学位期间，在导师指导下完成的博士学位论文。我承诺：本论文中所涉及的所有数据、试验记录以及研究结果均真实可信，引用资料已注明出处，无剽窃、篡改、抄袭之行为。如本论文原创性方面出现问题，我愿负法律责任。本课题的研究成果归中国疾病预防控制中心所有，发表文章的单位署名为中国疾病预防控制中心。特此声明!学位论文作者( 签名) ：研究生导师( 签名) ：磅社；12 0 0 7 年7 月专。日2 0 0 7 年A pB中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所博士学位论文麻疹病毒载体的优化与改造博士研究生：修梅红导师：李德新教
10、授中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所摘要病毒减毒活疫苗在预防和控制病毒性传染病方面发挥了重要的作用，以重组R N A 病毒为载体的疫苗也具有同样的作用，并具有多价免疫的优势。1 9 9 4 年弹状病毒科中狂犬病毒反向遗传学方法的建立，率先完成单股负链R N A 病毒拯救，随后几年许多实验室对其他一些N N S 病毒进行了相应的探索。N N S 家族成员包括：弹状病毒科；副粘病毒科；丝状病毒科；玻那病毒科。在这些病毒中，麻疹病毒减毒活疫苗在世界范围内获得了广泛的应用，被证明安全有效。麻疹病毒( M V ) 属于副粘病毒科麻疹病毒属，副粘病毒为一组有包膜病毒，基因组为单股、线性、不分节段的负链R
11、 N A ，长度约为1 5 5 k b 。以麻疹病毒载体发展为多价疫苗进行免疫接种既可以预防麻疹又可用于预防其他的传染性疾病，如艾滋病，登革出血热或者流行性感冒等，成为世界上疫苗研发领域的热点。本研究在如何提高拯救效率，提高下游基因的转录水平，方便外源基因引入等方面进行了探索，并对重组有外源基因的麻疹病毒全基因组感染性克隆进行拯救。构建了适合麻疹病毒感染的V e t o 细胞T 7R N A 聚合酶稳定表达细胞系，用以启动麻疹病毒全基因组的转录并与常用的痘苗病毒表达系统进行比较分析。置于T 7 启动子控制下的全基因组质粒的转录水平受到很多因素影响，鸟嘌呤是其中的一个重要影响因素。本研究构建了麻
12、疹病毒微复制子并以其为模型来研究如何提高病毒的拯救效率。首先对鸟嘌呤和锤头状核酶对转录水平的影响进行比较分析，在麻疹病毒微复制子质粒的基础上，我们构建了含有3 个鸟嘌岭( G ) 和锤头状核酶( H a m R z ) 的P m i n i E G F P 3 G 、2 个G 和H a m R z 的P m i n i E G F P 2 G 、不含G 只含H a m R z 的P m i m E G F P O G 和含有3 个G 但不含H a m R z 的P m i n i E G F P 3 G 一共4 个质粒。拯救后通过荧光分析和F A C S 分析对4 个质粒的拯救效率进行比较，结
13、果表明，P m i n i E G F P 3 G 的拯救效率最高，而P m i n i E G F P O G 的拯救效率比较低，P m i n i E G F P 3 G 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所博士学位论文质粒由于与副粘病毒科6 的倍数原则相违背，拯救效率最差。可见，乌嘌呤对微复制子质粒的拯救效率有影响，3 个鸟嘌呤与锤头状核酶的结合是提高微复制子质粒拯救效率的最佳组合。本研究针对鸟嘌呤对麻疹病毒拯救效率的影响进行了研究，为以T 7 启动子为基础的单股负链R N A 病毒的拯救进行了有益的探索。M v 病毒全基因组的转录是在T 7 启动子的控制下，产生的负链基因组与病毒结构蛋
14、白N 、P 、L 形成R N P 后，充当R N A 合成的模板。但是在真核细胞中不具有T 7R N A 聚合酶，转录过程的实现必须通过外源来提供聚合酶。我们构建了一株稳定表达T 7 R N A 聚合酶的细胞系( V e r o p c D N A 3 T 7 ) ，用于麻疹病毒的拯救过程。经免疫印迹实验表明在无选择压力情况下，连续传4 0 代( 约1 2 0 天) T 7R N A 聚合酶基因在v e f o 细胞中可以稳定表达。将T 7 启动子控制下含有报告基因( E G F P ) 的表达质粒p T 7 I P E G F P 转染细胞后，绿色荧光蛋白能够表达，表明表达出的蛋白具有聚合酶
15、的活性，能够驱动T 7 启动子下游基因的表达。将反向插入报告基因的微复制子质粒P m i n i E G F P 转染已经感染过麻疹病毒c c 4 7 株的细胞V e r o p c D N A 3 T 7 ，细胞株中能够检测到报告基因的表达，与痘苗病毒T 7 载体系统相比报告基因的拯救量增加，并且细胞无明显死亡，显示了拯救方法的优越性。麻疹病毒基因的转录起始于病毒基因组的3 端，聚合酶沿着基因起始( G S ) 和基因结束( G E ) 信号序列顺序依次进行转录，每经过一个基因转录水平就会明显下降。本研究对本实验室莳期构建的麻疹病毒全基因克隆进行进一步优化和修饰。首先将麻疹病毒N P 基因问
16、结构类似的G S 和G E 信号序列，插入到麻疹病毒基因组结构基因P 和M 之间非必须区域，命名为N P a i g r 结构，并在G S 和G E 之间引入多克隆位点以利于外源基因的引入。为验证合成的N P a i g f 结构是否具有驱动外源基因表达的功能，我们在麻疹病毒微复制子质粒的基础上构建双顺反子质粒p M V a i g r E G F P H T N S ，其结构为：启动子一H a m R z - M V5 T r a i l o r - 反向E G F P - N P a i g r -反向汉滩病毒核蛋白基因( H T N S ) M V3 L e a d e r - H d v R z 。结果表明，在M V 预先感染的V e r o p c D N A 3 T 7 细胞中，报告基因绿色荧光蛋白能够表达，说明N P a i 掣结构能够驱动其下游的基因表达。然后将N P a i 掣结构克隆到M V 全基因组克隆中，将汉滩病毒8 4 F L i
