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1、用多结合性阴离子交换剂去除 MAb 污染GE Healthcare 最近推出的 Capto adhere 多结合性阴离子交换树脂对蛋白 A 分离后残留的污染物具有高选择性，只需增加一个步骤，就能实现高效的单克隆抗体下游工艺开发。蛋白 A 树脂捕获后的高纯度，再加上 Capto adhere 树脂的多结合性功能，构成了高产的两步工艺。 在目前正在开发中的生物制药产品中，单克隆抗体（MAb）大约占了三成(1)。过去几十年对单克隆抗体需求的持续增长导致了高表达细胞培养技术的密集开发(2)。时至今日， 4-5 g/L 的产率已不足为奇，表达水平高达 15 g/L 甚至更高也时有报道。因此，对更高效下游
2、处理工艺的需求也随之不断增长。这种需求，再加上缩短上市时间的潜力，让人们对单克隆抗体生产（上游及下游）的通用平台技术更加感兴趣。现在许多单克隆抗体生产厂家都开始采用这种方法。目前为止，几乎所有获批准的单克隆抗体工艺都包含一个蛋白 A 的捕获步骤。在常规步骤中，蛋白 A 树脂直接从澄清的细胞培养物上清中捕获单克隆抗体，它的高选择性使之可高产量地获得很高纯度的产物。因此，蛋白 A 为大多数单克隆抗体以通用平台技术进行下游处理的成功奠定了基础。最近推出的 Capto adhere 多结合性阴离子交换树脂对蛋白 A 分离后残留的污染物具有高选择性，只需增加一个步骤，就能实现高效的单克隆抗体下游工艺开发
3、(3)。蛋白 A 树脂捕获后的高纯度，再加上 Capto adhere 树脂的多结合性功能，构成了高产的两步工艺(4,5)。单克隆抗体平台工具箱单克隆抗体平台工具箱平台技术包含一系列以性质相似的同类分子的纯化经验为基础的单元操作、方法及条件(6-10)。已有 20 多种获批准的产品以及 160 多种还在临床试验中的单克隆抗体，正是这样一类分子(1)。所有单克隆抗体生产平台技术的基础，正是蛋白 A 的独特选择性。平台技术能实现快速而经济的工艺开发和放大。通过缩短开发时间，它将有助于众多候选药物通过开发实验室。采用高度类似的通用平台技术也将令从研发到生产之间的工艺转换更加可靠、更加顺利。由于单克隆
4、抗体类似但不相同，它们的平台也就不能在细节上完全固定，必须要灵活。因此，蛋白 A 步骤后的层析步骤可能在次序上有所改变，或工艺间存在微小的差异。为此，可以采用工具箱的概念（图 1）来建立有效的单克隆抗体纯化工艺。图 1：单克隆抗体层析树脂工具箱*WO 2004/485，Lonza 专利应用，与一个包括蛋白 A 处理后进行阴离子交换层析的工艺相关。为了获得最佳结果，优化单克隆抗体工艺的每个步骤是非常重要的，包括蛋白 A 捕获步骤。我们推荐的平台包括用 MabSelect SuRe 蛋白 A 树脂进行捕获，尽管 MabSelect 和MabSelect Xtra 系列在单克隆抗体纯化平台上效果也很
5、好。MabSelect SuRe 产品包含耐碱性的、源自蛋白 A 的配基，可以耐受 0.1-0.5 M NaOH 作为在位清洗（CIP）的试剂，因此比其他蛋白 A 树脂具有更长的使用寿命(11,12)。就蛋白水解而言，这种配基比常规（天然或重组）的蛋白 A 配基更稳定，从而进一步减少了配基脱落。此外，对于多种单克隆抗体和 Fc 融合蛋白，配基不与 Fab 结合意味着允许更广泛的洗脱条件如 pH(13)。以上种种都促进了通用平台技术的推广。以 MabSelect SuRe 为代表的蛋白 A 树脂所具有的独特选择性使得两步层析工艺成为可能。这些工艺已有报道(14,15)。多结合性阴离子交换剂多结合
6、性阴离子交换剂通用电气医疗集团的 Capto adhere 阴离子交换剂提供专为单克隆抗体工艺中蛋白 A 捕获后纯化而设计的多种结合功能。蛋白 A 捕获后的产物穿流（flow-through）通过 Capto adhere 树脂，残留在产品中的污染物结合在 Capto adhere 树脂而被去除。图 2 展示了 Capto adhere 配基：N-苯甲基-N 甲基乙醇胺。此配基显示多种不同的相互作用模式，最主要是离子相互作用。但其他形式的相互作用如氢键和疏水作用也有参与。图 2：Capto adhere 配基 N-苯甲基-N 甲基乙醇胺可参与几种类型的相互作用，最主要的是离子相互作用、氢键和疏
7、水作用。多结合性的阴离子交换剂与传统的强阴离子交换剂（如 Q-types）相比，有着不同的选择性。图 3 比较了 Capto adhere 和 Capto Q 树脂对 5 种不同单克隆抗体的结合-洗脱模式，其中洗脱液是 pH 值梯度递减的。两者的洗脱顺序相同，但是 Capto adhere 上产品洗脱的pH 低很多。这表明额外的相互作用及多结合功能导致了不同的选择性。Capto adhere 树脂最初是为单克隆抗体纯化而设计，最近也有报道称它成功应用于 Fc 融合蛋白的纯化(16)。此外也不能排除多结合性阴离子交换剂在其他方面的应用，如纯化其他类型重组蛋白的纯化。图 3：Capto adher
8、e 和 Capto Q 树脂对 5 种不同抗体的洗脱比较。抗体洗脱的顺序相同， 而 Capto Q 更早洗脱（在更高 pH）。两者是在不同 pH 梯度范围内洗脱的（Capto adhere树脂是 pH 6.2-4.9，Capto Q 树脂则是 pH 9.9-6.2）。条件优化条件优化在单克隆抗体的纯化过程中，Capto adhere 树脂应用于蛋白 A 处理后，以去除残留的污染物。在一定的条件下，采用穿流（flow-through）的方式，令抗体直接通过柱子，而污染物被吸收，即可很好地去除残留污染。在穿流（flow-through）方式中，进样条件应该在产量优先和清除污染物优先的条件之间进行折
9、衷。因此进样条件需要优化，以便在产量和纯度间找到一个平衡。使用统计学的 design of experiments (DoE)即可很好地完成进样条件的优化。在优化 Capto adhere 的进样条件时，我们发现上样量、pH 值和电导率是最关键的因素。优化这些参数可同时影响产量和污染物的去除。在 DoE 中，所有因素以结构化的方式同时改变。常用的方法是确定一个对照试验（中心点），并围绕这个点进行其他实验。DoE 范例：起始物质是澄清的、包含单克隆 IgG1 的细胞培养物上清。在用蛋白 A 层析捕获后，在低 pH 条件下进行病毒灭活。接着以穿流（flow-through）的方式经过 Capto
10、adhere 树脂做进一步加工。以三种变量（上样量、pH 值和电导率）和三个中心点建立全因子设计，以便了解对产量和关键污染物去除的影响。关键污染物包括：宿主细胞蛋白（HCP）、二聚体/聚集物（D/A）、以及脱落的蛋白 A（图 4）。图 4：优化进样条件的全因子设计（进样量在 75-300 mg/ml 之间，pH 68, 电导率在 2-15 mS/cm 之间）分别针对产量或者 HCP、D/A 以及脱落的蛋白 A 的清除创建了不同的模型（图 5）。反应面显示了上样量、pH 和电导率如何影响不同的反应，以及如何达到每一个的理想值。根据以下接受标准进行最佳点分析：在上样量100 g/L 树脂时，穿流（
11、flow-through）的产量应该90%，HCP 50 ppm，D/A 1%，脱落的蛋白 A5 ppm。最佳点（图 6）是指在某一点（红色）能同时达到产量和污染物去除的目标。由于 HCP 和蛋白 A 去除的目标在整个实验空间中均可完成，因此此例中的优化集中在产量和 D/A 去除。图 5：产量和宿主细胞蛋白（HCP）、二聚体/聚集物（D/A）、以及脱落的蛋白 A去除的反应面范例图 6：包含实验设计中所有实验数据的最佳点分析操作操作Capto adhere 分离是以让抗体直接流过柱子同时污染物被吸收的方式进行。其中一种需要降低或去除的污染物就是以聚集物形式存在的单克隆抗体本身。利用 Capto
12、adhere 树脂不仅能降低聚集物的量，还能减少其他关注的污染物，如 HCP、DNA、蛋白 A 和病毒。表1 概括了蛋白 A 捕获后用多结合性阴离子交换剂预计能去除的污染物。病毒去除效率倍受关注。因此进行了一项有关去除小鼠微小病毒（MVM）和鼠源白血病病毒（MuLV）的研究。表 2 展示了研究结果。两种病毒模型均可在较高和较低的离子强度下被有效去除。而传统的阴离子交换剂如 Q-resin，则不能在较高离子强度下很好地清除病毒。表 1：在蛋白 A 捕获后用 Capto adhere 树脂预期能去除的污染物概览（MVW=小鼠微小病毒；MuLV=鼠源白血病病毒；LRF=对数下降值）表 2：Capto
13、 adhere 多结合性阴离子交换剂去除病毒的效率；在 pH 6.75 时，小鼠微小病毒（MVM）及鼠源白血病病毒（MuLV）与 IgG 单克隆抗体一起进样并流经（flow-through）Capto adhere 多结合性阴离子交换剂（LRF=在 95% 置信限时的对数下降值）。将蛋白 A 树脂的高选择性与 Capto adhere 阴离子交换剂的独特去污染特性相结合，有望削减许多纯化步骤，将三步层析缩减到两步。要想在实践中实现这个目标，最关键之处在于：不仅要优化多结合性的阴离子交换剂，还要优化最初的捕获步骤。最新开发的 MabSelect SuRe 树脂正是此目的的最佳选择。这种碱性稳定的
14、配基能用 NaOH 进行在位清洗。它的关键优势是已经证实使用寿命长，高动态结合能力和低配基脱落(11, 12, 17, 18)。为了进一步优化捕获步骤，在某些情况下需要再增加中间的洗涤步骤，以便在洗脱前去除松散结合的污染物(19)。图 7 显示了对一种单克隆抗体进行两步纯化的实例。起始物质是澄清的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞上清，混有宿主细胞蛋白（HCP）。利用 MabSelect SuRe 蛋白 A 树脂进行抗体捕获。在进样之后，用 pH 7.0 的 20 mM 磷酸钠、5% 异丙醇和 0.5 M NaCl 进行中间的冲洗步骤。对冲洗组分的分析表明它主要含有抗体聚集物和 HCP (19)。随后
15、用 pH 3.4的柠檬酸钠进行单克隆抗体的洗脱。HCP 浓度从 130,000 ppm 降低到 55 ppm，残留的聚集物含量为 0.7%。MabSelect SuRe 洗脱物接着穿流（flow-through）经过 Capto adhere 阴离子交换树脂以进行进一步纯化。从结果中可以看出，污染物的去除效果非常好。HCP 水平减低至10 ppm，而聚集物和脱落的蛋白 A 水平都降至检测极限以下。图 7：从 CHO 细胞培养物中纯化单克隆抗体（MabSelect SuRe 捕获步骤之后以穿流（flow- through）方式通过 Capto adhere）两步层析工艺与三步处理过程相比，有着显
16、而易见的优势：步骤减少能提高产量并缩短处 理时间，即意味着更高的生产率（单位时间内产生的产物克数）。两步平台工艺还提高了 工艺的经济性。此外，需要使用的层析树脂减少，仪器和缓冲液用量也减少，而生产企业 所需的占地面积也可减少。当从生产率到工艺经济的角度进行工艺优化时，遵循精益概念 是非常有益的。减少浪费、原料尤其是时间，将实现更有效的生产(20)。正如本文描述的，Capto adhere 通常以穿流（flow-through）的方式进行，但在某些情况 下，以结合-洗脱的方式可能更为有利(16)。此外，某些单克隆抗体制备包含的抗体片段水 平（fragment levels ）对于最终产物来说过高。单克隆抗体片断与此树脂的结合力较弱， 因此能与单体单克隆抗体分离开。二聚体和其他聚集物的结合力要强得多，因而会在单体 单克隆抗体之后被洗脱下来。以结合-洗脱的方式使用这种多结合性阴离子交换剂在某些情况下具有一些优势。不过它也 有着明显缺陷：承载能力。穿流（flow-through）方式的载量通常为 100-300 g/L 树脂； 而结合-洗脱方式仅为 25-40 g/L。然而，能够
