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1、 J. Lake Sci.(湖泊科学), 2009, 21(6): 801-805 http:/www.jlakes.org. E-mail: 2009 by Journal of Lake Sciences 太湖梅梁湾水华微囊藻基因型组成和产毒微囊藻丰度的变化* 施丽梅1,2, 蔡元锋1, 杨华林1, 李朋富1,2*, 孔繁翔2 , 孔令东1 (1: 南京大学生命科学学院, 南京 210093) (2: 中国科学院南京地理与湖泊研究所湖泊与环境国家重点实验室, 南京 210008) 摘 要: 采用基于ITS序列的PCR-DGGE方法分析了太湖梅梁湾水华暴发过程中(6-11月)微囊藻的不同基
2、因型组成的变化, 同时利用针对微囊藻毒素合成酶基因mcyA和微囊藻特异性的16S rDNA部分核苷酸序列的引物, 应用实时荧光定量PCR方法(qRT-PCR)分析水华样品中产毒微囊藻与总微囊藻的量, 通过两者的比值反映产毒微囊藻丰度. 结果表明, 在发生水华的不同时期, 微囊藻的基因型组成发生了变化, 其中以8月末、9月和10月的基因型最多, 基因型M5和M10存在于整个水华发展过程中共检测到12种主要的基因型, 每个基因型在水华的不同时期所占的比例互不相同实时荧光定量PCR结果显示从6月到10月, 产毒微囊藻的丰度呈增大的趋势, 从0.75%增加到32.16%, 而11月产毒微囊藻的丰度显著
3、下降 关键词: 微囊藻; 产毒微囊藻; ITS; 实时荧光定量PCR; DGGE; 水华; 太湖 Dynamics of composition of different Microcystis spp. genotypes and abundance of toxic Microcystis in Meiliang Bay of Lake Taihu during bloom SHI Limei1,2, CAI Yuanfeng1, YANG Hualin1, LI Pengfu1,2, KONG Fanxiang2 toxic Microcystis; ITS; qRT-PCR; DGGE
4、; bloom; Lake Taihu 蓝藻水华在富营养化的水体中频繁发生已经是一个全球性的环境问题, 其中微囊藻(Microcystis spp.)是一个在全世界广泛分布的水华蓝藻种类1. 研究水华暴发过程中蓝藻种类组成的变化是理解蓝藻水华发生规律的一个重要方面. 基于16S-23S rRNA-ITS序列的PCR-DGGE方法可以将不同基因型的微囊藻在 * 国家重点基础研究发展计划(973)项目(2008CB418004)和江苏省自然科学基金项目(BK2007150)联合资助. 2009-01-15收稿; 2009-04-07 收修改稿. 施丽梅, 女, 1983 年生, 博士研究生; E-
5、mail: . * 通讯作者; E-mail: . J. Lake Sci.(湖泊科学), 2009, 21(6) 802 DGGE图谱上区分2, 运用这种方法, Humbert等分析了法国Grangent水库中存在的微囊藻不同基因型3, Kardinaal等对荷兰三个湖泊的研究表明伴随着水华的发展, 存在着微囊藻不同基因型的演替现象, 包括产毒藻和不产毒藻的演替4. 谭啸等比较分析了太湖春、夏、秋、冬四季微囊藻群落组成, 发现夏、冬两季微囊藻彼此分离成两大特征类群, 而春、秋两季的微囊藻彼此混杂5. 但是, 目前没有发现针对太湖微囊藻水华暴发过程中不同微囊藻基因型组成变化的研究报道. 利用酶
6、联免疫吸附法(ELISA)和高效液相色谱法(HPLC)可以检测水体中微囊藻毒素含量的变化, 但是不能直接反映产毒微囊藻丰度的变化. 微囊藻毒素是由基因簇 mcy 编码的毒素合成酶合成的, 针对该基因簇的 mcyA、 mcyB 和 mcyC 基因, 利用分子生物学方法检测环境中具有产毒潜力的微囊藻藻株已经被国内外学者广泛采用6-10. 其中应用针对 mcyA 基因的特异性引物借助实时荧光定量 PCR(qRT-PCR)方法分析产毒微囊藻的含量被证明是快速和准确的11. 目前未见利用产毒基因检测太湖产毒微囊藻的报道.本文采用基于 rRNA-ITS 的 DGGE 方法研究了太湖梅梁湾水华暴发过程中的微
7、囊藻基因型组成的变化, 同时采用 qRT-PCR 方法分析了产毒微囊藻丰度的变化, 旨在揭示太湖梅梁湾微囊藻基因型的演替规律. 1 材料与方法 1.1 微囊藻基因型组成分析 1.1.1 样品的采集和总 DNA 的提取 2008 年 6-11 月微囊藻水华发生期间, 在太湖梅梁湾采集水样, 实验室内用 0.22m 滤膜过滤后, 采用 XS 方法提取样品的基因组 DNA12. 1.1.2 PCR-DGGE 分析微囊藻基因型的组成 采用针对 rRNA-ITS 序列的一对引物 CSIF(5-GTCCACGCC -CGAAGTCGATTAC-3)和 ULR(5-CCTCTGTGTGCCTAGGTATC-
8、3)4, 以提取的 DNA 为模板进行 PCR扩增, 其中引物CSIF的5端连接着40个碱基的GC发夹结构(5-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCC -GCCGCCCCCGCCCC-3). 采用 Touchdown PCR 策略, 条件如下: 94预变性 5min, 以下为 94 1min, 62-52 1min(每 2 个循环降 1), 72 1min, 共 20 个循环, 后 10 个循环用 52退火, 最后 72下延伸30min. 变性梯度凝胶电泳(DGGE)采用美国CBS公司电泳仪, 条件为: 聚丙烯酰胺凝胶浓度8%, 变性梯度30%-60%(100%变性剂含有7mol
9、/L尿素和40%去离子甲酰胺), 电泳缓冲液为1TAE, 60条件下75V电泳16h. 电泳完成后聚丙烯酰胺凝胶用SYBR Green (用TAE稀释10000倍)染色30min, 用Omega 10TM全自动多功能凝胶成像分析系统拍照. DGGE图谱中优势条带的相对含量采用Gel-Pro软件分析, 并根据分析结果作基因型组成柱状图. 从聚丙烯酰胺凝胶上切下优势条带, 放到1.5ml无菌离心管中捣碎, 加入TE缓冲液30l, 4过夜溶出DNA, 离心后取上清为模板, 用上述同样的引物(其中CSIF不含GC夹)和程序进行PCR扩增. PCR产物送上海生工生物工程技术有限公司测序, 将所测的rRN
10、A-ITS序列在GenBank数据库中进行相似性比对. 同时将测序结果提交到GenBank, 序列号为FJ602437-FJ602446. 1.2 实时荧光定量 PCR 法分析产毒微囊藻的丰度 1.2.1 所用引物 使用下述引物分别扩增样品中的产毒微囊藻以及总微囊藻的部分 DNA 片段. MSF(5-ATCCAGCAGTTGAGCAAGC-3)和 MSR-2R(5-GCCGATGTTTGGCTGTAAAT-3)是针对产毒微囊藻毒素合成酶基因 mcyA 的特异性引物11. 引物 MICR 184F(5-GCCGCRAGGTGAAAMCTAA-3)和MICR 431R(5-AATCCAAARACC
11、TTCCTCCC-3)是针对一段保守的微囊藻特异性的 16S rDNA 片段13. 1.2.2 标准品的制备 采用XS方法提取铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa PCC 7806)的基因组DNA作为模板, 用上述两对引物分别进行PCR扩增, 反应体系总体积为50l, dNTP 200M、 10M的引物各1l、 MgCl2 4.0mM、 Taq酶2.0个单位、 10PCR缓冲液5l. 产毒微囊藻PCR反应条件为95预变性10min, 以下为95 10s, 62 10s, 72 30s, 共35个循环11. 总微囊藻PCR反应条件如下: 95预变性10min, 以下为95 1
12、0s, 55 10s, 72 30s, 共45个循环13. 将纯化后的PCR产物连接到pGEM-T载体, 构建重组质粒, 经转化感受态细胞和扩增培养后提取质粒DNA, 紫外吸收定量法(OD260)检测浓度后, 将其进行10倍梯度稀释, 形成103-108拷贝/l, 作为标准品4保存备用. 施丽梅等: 太湖梅梁湾水华微囊藻基因型组成和产毒微囊藻丰度的变化 8031.2.3 标准曲线的绘制 进行荧光定量 PCR 反应的仪器为 ABI Prism 7000, 扩增反应体系总体积为 25l, 包括12.5l SYBR Green 混合液(包括DNA Taq酶, Mg2+, dNTP, SYBR Gre
13、en 和10PCR缓冲液)、 10 M的引物各 0.5l、 10.5l 灭菌重蒸水和 1l 作为模板的上述各浓度梯度 DNA, 置于 PCR 管板中, 进行自动化扩增反应. PCR 反应条件分别同上所述, 分析总微囊藻的循环数增至 55 个, 分析产毒微囊藻的循环数增至 45 个. 以初始模板 DNA 量的对数为横坐标, 以 PCR 反应过程中每个稀释样品的 Ct 值为纵坐标, 分别绘制总微囊藻及产毒微囊藻的标准曲线. 1.2.4 产毒微囊藻丰度的分析 将从太湖水华样品中提取的基因组DNA作为模板, 分别经两对引物进行qRT-PCR扩增后, 从仪器读取样品的Ct值, 用标准曲线方程计算出产毒微
14、囊藻及总微囊藻的初始拷贝数, 两者之比即为产毒微囊藻在水华样品中的丰度. 2 实验结果 2.1 PCR-DGGE 分析微囊藻不同基因型的演替 PCR-DGGE 分析不同时期的微囊藻水华样品(图 1), 共得到了 12 个不同的优势条带. 在水华的不同时期, 微囊藻的基因型组成不同(图 2). 在 6 月 7 日, 主要的微囊藻基因型有 6 种, 包括 M1、M2、M3、M5、M8 和 M10; 在 7 月 4 日和 8 月 6 日, 以 M3、M5、M8 和 M10 基因型为主, M1 和 M2 的比例减少; 在 8 月 26 日、9 月 11 日和 10 月 18 日, 微囊藻的基因型是最丰
15、富的, 其中 M0、M4、M11 和 M9 的比例相对于其它时期有明显增加; 在 11 月 2 日, 微囊藻的基因型较少, 主要是 M3、M5、M8 和 M10. M5 和M10 是所调查的月份中都存在的基因型, 在不同的时期各微囊藻基因型的相对含量是不相同的. 图 1 水华不同时期微囊藻基因型的 DGGE 图谱 (泳道顶部数字为采样时间, 图中“”标记为割胶回收的 12 个条带) Fig.1 DGGE profiles of Microcystis genotype succession in Lake Taihu during bloom 图 2 水华不同时期主要微囊藻基因型组成的变化 F
16、ig.2 Dynamics of composition of the dominant Microcystis genotypes in Lake Taihu during bloom J. Lake Sci.(湖泊科学), 2009, 21(6) 804 将ITS序列通过BLAST比对看出(表1), 微囊藻基因型M1与其最相近的铜绿微囊藻藻株(AM773538)之间具有 100%的相似性, 基因型 M9 与其最相近的藻株相似性是 96%, 其它基因型与其最相近的藻株的相似值都在 97%-99%之间. M0 和 M11 测序不成功. 表 1 代表微囊藻基因型的 DGGE 条带序列分析结果 Tab.1 Characterization of Microcystis genotypes ba
