浅析生物化学中的关键技术

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1、浅析生物化学中的关键技术浅析生物化学中的关键技术学校：assf院系：生物技术班级：117学号：05姓名：lee电话：12842516521浅析生物化学中的关键技术浅析生物化学中的关键技术关键技术一：电泳关键技术一：电泳 电泳（Electrophoresis）是指带电荷的粒子或分子在电场中移动的现象称 为电泳。大分子的蛋白质，多肽，病毒粒子，甚至细胞或小分子的氨基酸，核 苷等在电场中都可作定向泳动.1937 年 Tiselius 成功地研制了界面电泳仪进行 血清蛋白电泳，它是在一 U 型管的自由溶液中进行的，电泳后用光学系统使各 种蛋白所形成折光率差别成为曲线图象，将血清蛋白分为白蛋白，1-球蛋

2、白， 2-球蛋白，-球蛋白和 -球蛋白五种，随后，Wielamd 和 Kanig 等于 1948 年采用滤纸条做载体，成功地进行了纸上电泳。从那时起，电泳技术逐渐 被人们所接受并予以重视，继而发展以滤纸，各种纤维素粉，淀粉凝胶，琼脂 和琼脂糖凝胶，醋酸纤维素薄膜，聚丙烯酰胺凝胶等为载体，结合增染试剂如 银氨染色，考马斯亮蓝等大大提高和促进生物样品着色与分辨能力，此外电泳 分离和免疫反应相结合，使分辨率不断朝着微量和超微量（1ng0.001ng）水 平发展，从而使电泳技术获得迅速推广和应用。在此主要介绍常用电泳的一般 原理及其应用. 电泳的基本原理如果把生物大分子的胶体溶液放在一个没有干扰的电场

3、中，使颗粒具有恒 定迁移速率的驱动力来自于颗粒上的有效电荷 Q 和电位梯度 E.它们与介质的摩 擦阻力 f 抗衡。在自由溶液中这种抗衡服从 Stokes 定律. F=6rv 这里 v 是在介质粘度为 中半径为 r 的颗粒的移动速度。但在凝胶中，这 种抗衡并不完全符合 Stokes 定律.F 取决于介质中的其他因子，如凝胶厚度， 颗粒大小，甚至介质的内渗等。 电泳迁移率(mbility)m 规定为在电位梯度 E 的影响下，颗粒在时间 t 中的 迁移距离 d. d m= - 或 m=V / E tE 迁移率的不同提供了从混合物中分离物质的基础，迁移距离正比于迁移率。影响电泳的因素影响电泳的因素1.

4、电泳介质的 pH 值 2.缓冲液的离子强度 3. 电场强度 4.电渗现象 电泳所需的仪器电泳所需的仪器 电泳所需的仪器有：电泳槽和电源。 电泳技术的应用电泳技术的应用1 聚丙烯酰胺凝胶电泳可用做蛋白质纯度的鉴定 2 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳可测定蛋白质分子量. 3 聚丙烯酰胺凝胶电泳可用于蛋白质定量。 4 琼脂或琼脂糖凝胶免疫 关键技术二：超离心关键技术二：超离心胶体粒子在重力场或普通的离心力场中沉降极为缓慢，实际上无法测定 其沉降速度。 1924 年瑞典科学家Svedberg研制成超离心机，其转速比普通 离心机大大提高，现在超离心机的离心加速度已达到重力加速度的106 以 上，从而可以对胶

5、体粒子进行沉降分离和分析，这称作超离心法。超离心法 是瑞典化学家Svedberg于 1940 年设计的，广泛地用于蛋白质分子的分离与 分析。他所采用的原理是蛋白质颗粒会在250000500000g 的离心作用下从 溶液中沉降下来 。 数据表: : 型号 零件号 转筒驱动: 马达: 1MJ6 1250.180.99-82 变频器: ACS550-01-045A-4 1028.296.30 螺旋驱动: 马达: 1MJ6 1250.132.70 变频器: ACS550-01-015A-4 1028.300.30 齿轮箱油位: UNS-1000 1125.027.10转筒主转速与差速测量转筒主转速与差

6、速测量福乐伟离心机带SIMP-DRIVE1. 主转速：转筒主转速在离心机的齿轮凸边缘，由触点式感应转换器测量。 转换器每旋转一次，发出4次脉冲信号。 因此，输入频率也被分成4次，转换器将每分钟转数转换为主转速，同时监测。2. 螺旋差速：螺旋差速在齿轮输入轴处，由触点式感应转换器测得。 转换器每旋转一次，发出4次脉冲信号。 因此，输入频率也被分成4次；同时，也产生了齿轮输入轴的速度。 输入轴的速度由齿轮传动速比分配，转换器将每分钟转数转换为差转速，同时 监测。关键技术三：同位素标记关键技术三：同位素标记同位素标记法：同位素可用于追踪物质的运行和变化规律。借助同位素原子以研究有机反应历程的方法。即

7、 同位素用于追踪物质运行和变化过程时，叫做示踪元素。用示踪元素 标记的化合物，其化学性质不变。 科学家通过追踪示踪元素标记的化合物，可以弄清化学反应的详细过程。这种科学研究方法叫做 同位素标记法 。基基本本原原理理同位素示踪所利用的放射性核素（或稳定性核素）及它们的化合物，与自然界存在的相应普通元素及其化合物之间的化学性质和生物学性质是相同的，只是具有不同的核物理性质 。因此，就可以用同位素作为一种标记，制成含有同位素的标记化合物（如标记食物，药物和代谢物质等）代替相应的非标记化合物。利用 放射性同位素 不断地放出特征射线的核物理性质，就可以用核探测器随时追踪它在体内或体外的位置、数量及其转变

8、等，稳定性同位素虽然不释放射线，但可以利用它与普通相应同位素的质量之差，通过质谱仪，气相层析仪，核磁共振等质量分析仪器来测定。放射性同位素和稳定性同位素都可作为 示踪剂（tracer），但是， 稳定性同位素作为示踪剂其灵敏度较低，可获得的种类少，价格较昂贵，其应用范围受到限制；而用放射性同位素作为示踪剂不仅灵敏度，测量方法简便易行，能准确地定量，准确地定位及符合所研究对象的生理条件等特点。三、同位素标记法在生物化学和分子生物学中的应用 放射性同位素标记法在生物化学和分子生物学领域应用极为广泛，它为揭示体内和细胞内理化过程的秘密，阐明生命活动的物质基础起了极其重要的作用。近几年来，同位素标记技术

9、在原基础上又有许多新发展，如双标记和多标记技术，稳定性同位素标记技术，活化分析，电子显微镜技术，同位素技术与其它新技术相结合等。由于这些技术的发展，使生物化学从静态进入动态，从细胞水平进入分子水平，阐明了一系列重大问题，如遗传密码、细胞膜受体、RNA-DNA 逆转录等，使人类对生命基本现象的认识开辟了一条新的途径。下面仅就同位素标记技术在生物化学和分子生物学中应用的几个主要方面作一介绍。关键技术四：层析层析（chromatography）是“色层分析”的简称。利用各组分物理性质的不同， 将多组分混合物进行分离及测定的方法。有吸附层析、分配层析两种。一般用 于有机化合物、金属离子、氨基酸等的分析

10、。层析利用物质在固定相与流动相 之间不同的分配比例，达到分离目的的技术。层析对生物大分子如蛋白质和核 酸等复杂的有机物的混合物的分离分析有极高的分辨力。基基本本原原理理层析须在两相系统间进行。一相是固定相，需支持物，是固体或液体。另一相为流动相，是液体或气体。当流动相流经固定相时，被分离物质在两相间的分配，由平衡状态到失去平衡到又恢复平衡，即不断经历吸附和解吸的过程。随着流动相不断向前流动，被分离物质间出现向前移动的速率差异，由开始的单一区带逐渐分离出许多区带，这个过程叫展层。 系数 K 是物质在两相中的浓度比。 K 值大，则在固定相中吸附牢， K 值小吸附差。各物质间的 K 值差别大，则易被

11、分离。不同类型层析的K 值含义不同，可视为吸附平衡常数，分配常数或离子交换常数等。 研究层析现象而发展的 塔板理论，与有机化学实验中的分馏法原理有些相似。被分馏的有机 溶剂在分馏柱内的填充物上形成许多热交换层，从而把低沸点溶剂先分馏出来，达到纯化的目的。在层析时用理论塔板数n 来衡量层析效能。 tR 为物质在层析柱上的保留时间， W 为洗脱下来的物质峰形的宽度。 n 值愈大表示层析柱的效能愈高。如用 理论塔板高度 H 表示，则包含了层析柱长度的因子。 式中 L 为层析柱的柱长。 H 值越大，则柱效越低。 此外影响层析分离效果的还有涡流扩散、纵向扩散和传质阻抗等因素。因此选择层析固定相支持物的粒

12、度、均匀度等物理性能，流动相的层析系统和温度等都是做好层析的关键。 几几种种常常用用的的层层析析吸附层析、分配层析、离子交换层析 、凝胶过滤层析 、亲和层析气相层析、纸层析薄层层析、高效液相层析 （又名高压液相色谱 ） 、反相层析、同系层析 层析法的最大特点是分离效率高，它能分离各种性质极相类似的物质。而且它既可以用于少量物质的分析鉴定，又可用于大量物质的分离纯化制备。因此，作为一种重要的分析分离手段与方法，它广泛地应用于科学研究与工业生产上。现在，它在石油、化工、医药卫生、生物科学、环境科学、农业科学等领域都发挥着十分重要的作用。 层析根据固定相基质的形式分类，层析可以分为纸层析、薄层层析和

13、柱层析。其中纸层析是指以滤纸作为基质的层析 。关键技术五：关键技术五：X X 射线光电子射线光电子。X 射线光电子能谱基于光电离作用，当一束光子辐照到样品表面时，光子可以被样品中某一元素的原子轨道上的电子所吸收，使得该电子脱离原子核的 束缚，以一定的动能从原子内部发射出来，变成自由的光电子，而原子本身则 变成一个激发态的离子。 在光电离过程中，固体物质的结合能可以用下面的方 程表示： Ek = h - Eb - s（18.1）式中 Ek 出射的光电子的动能, eV;h X 射线源光子的能量, eV；Eb 特定原子轨道上的结合能, eV；s 谱仪的功函, eV。 谱仪的功函主要由谱仪材料和状态决

14、定，对同一台谱仪基本是一个常数， 与样品无关，其平均值为 34eV。 在 XPS 分析中，由于采用的 X 射线激发源的能量较高，不仅可以激发出原 子价轨道中的价电子，还可以激发出芯能级上的内层轨道电子，其出射光电子 的能量仅与入射光子的能量及原子轨道结合能有关。因此，对于特定的单色激 发源和特定的原子轨道，其光电子的能量是特征的。当固定激发源能量时，其 光电子的能量仅与元素的种类和所电离激发的原子轨道有关。因此，我们可以 根据光电子的结合能定性分析物质的元素种类。 在普通的 XPS 谱仪中，一般采用的 Mg K 和 Al K X 射线作为激发源， 光子的能量足够促使除氢、氦以外的所有元素发生光

15、电离作用，产生特征光电 子。由此可见，XPS 技术是一种可以对所有元素进行一次全分析的方法，这对于未知物的定性分析是非常有效的。 经 X 射线辐照后，从样品表面出射的光电子的强度是与样品中该原子的浓 度有线性关系，可以利用它进行元素的半定量分析。鉴于光电子的强度不仅与 原子的浓度有关，还与光电子的平均自由程、样品的表面光洁度，元素所处的 化学状态，X 射线源强度以及仪器的状态有关。因此，XPS 技术一般不能给出 所分析元素的绝对含量，仅能提供各元素的相对含量。由于元素的灵敏度因子 不仅与元素种类有关，还与元素在物质中的存在状态，仪器的状态有一定的关 系，因此不经校准测得的相对含量也会存在很大的误差。还须指出的是，XPS 是一种表面灵敏的分析方法，具有很高的表面检测灵敏度，可以达到 10-3原子 单层，但对于体相检测灵敏度仅为 0.1%左右。XPS 是一种表面灵敏的分析技术， 其表面采样深度为 2.05.0 nm，它提供的仅是表面上的元素含量，与体相成分 会有很大的差别。而它的采样深度与材料性质、光电子的能量有关，也同样品 表面和分析器的角度有关。