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1、高脂血症通过抑制R I S K 信号通路影响七氟烷后处理心肌保护作用 敝储签名：逊指导教师签名：论文评阅人1 陶且主任医嘘揎划立红金医院评阅人2 ：酆住塞圭堡医垣浙江太堂隘屉筮三医院评阅人3 ：垫亟蠼副主鱼医垣浙江太堂随屉筮三医院 评阅人4 ：评阅人5 ：答辩委员会主席：盒里簦数援土洼壅左压麈处叠医院委员1 ：迕垂壬敛援浙江太堂医堂院委员2 ：夏强熬拯浙江太堂医堂瞳委员3 ：委员4 ：委员5 ：答辩日期：2 0 1 3 年5 月浙江大学研究生学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表
2、或撰写过的研究成果，也不包含为获得浙江大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：义1签字日期：矽膨年r 月3 日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解堂婆盘堂有权保留并向国家有关部门或机构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝垄盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：签字日期：一1 1 年搬nl5 月弓日导师张芎五x签字日期：一q 年r
3、 月17 日浙扛大学硕士学位论文致谢致谢转眼，三年硕士研究生学习即将结束了。感谢我的导师严敏教授，三年来她严肃的科学态度，严谨的治学精神，精益求精的工作作风，深深地感染和激励着我；她循循善诱的教导和不拘一格的思路给予我无尽的启迪。本课题从设计、具体研究实施到论文撰写，整个过程都在严敏教授的悉心指导下完成。导师对学科方向的准确把握、对学生特点的全面了解和为研究工作创造的良好条件，使我能够在三年时间内顺利完成硕士阶段的课程学习和论文工作。在研究生学习期间，导师给予我宽容、理解、支持以及无微不至的关心和帮助，谨在此对我的导师严敏教授表示诚挚的敬意和衷心的感谢!本论文的顺利完成，离不开众多老师、同学及
4、朋友的关心和帮助。在此衷心感谢浙江大学附属第二医院张冯江老师、郁丽娜老师，从课题选择，实验设计到论文的最终完成，都离不开他们的细心指导。感谢师兄马雷雷，师姐于静、杨美娟对我课题研究及论文撰写的指导和帮助，以及生活中对我的鼓励和支持。感谢同门朱曼华、温传允、周学龙、王灿灿、徐红娇、彭余楠、杨瑾婷和唐丽辉等等对我的帮助、支持和鼓励。感谢浙医二院麻醉科整个科研团队给我的帮助和支持。感谢我的家人对我的包容、理解、支持和鼓励。最后，对所有关心和帮助我的老师、同学和朋友们表示深深的感谢! 谢谢!署名：王文娜于浙江大学医学院日期：2 0 1 3 年5 月浙江大学硕上学位论文致谢T T浙江大学硕上学位论文中文
5、摘要高脂血症通过抑制R I S K 信号通路影响七氟烷后处理心肌保护作用浙江大学医学院麻醉科硕士研究生王文娜导师严敏中文摘要目的：吸入麻醉药后处理对缺血再灌注心肌具有保护作用，慢性高脂血症增加心肌对缺血再灌注损伤的敏感性。本研究探讨高脂血症对七氟烷后处理心肌保护作用是否有影响，及其可能的机制。方法：正常和高脂血症大鼠随机分组，进行在体心肌缺血3 0 m i n 再灌注1 2 0 m i n ，于复灌初始5 m i n 进行2 5 七氟烷后处理。阻断剂组于复灌前1 0 m i n 经尾静脉分别给予P 1 3 K 特异性抑制剂L Y 2 9 4 0 0 2 ( o 3 m g k g ，i V )
6、 和E R K l 2 抑制剂P D 9 8 0 5 9( 1 0 m g k g ，i v ) 。术中持续监测并记录平衡末( b a s e l i n e ) 、缺血2 5 m i n 、再灌注3 0 m i n 、6 0 m i n 、9 0 m i n 、1 2 0 m i n 心率( H R ) ，左室血流动力学各参数( L V D P , L V E D P ,士d p d t 。a x ) 。复灌末取心肌行T T C 复合伊文斯兰染色法测量心肌缺血危险区( 红色) 和梗死区( 白色) 面积。W e s t e r nb l o t 法测定缺血区心肌总A k t ，P A k t
7、，总E r k l 2 ，P E r k l 2 ，总G S K 3 3 ，P 一6 s I ( 3 1 3 ，B c l 一2 ，活化C a s p a s e 3 的表达量。结果：七氟烷后处理组( 3 4 4 士7 6 ) 明显减少了正常胆固醇血症大鼠再灌注心肌的梗死面积( 5 4 9 士5 6 ，P 0 0 5 ) 。8 周后高脂血症大鼠体重显著大于非高脂血症大鼠( P 茹一m敝浙江大学硕士学位论文正文一结果A0 0P A k tT b t a IA k t翌0 80 6O 40 20 0P E r k l 2T o t a lE r k l 2P - G S K 3 3T o t a
8、lG S K 3 3l l 一B c l 2G A P D H0 6o0 4 Z 凸 正 , 1 9壁o 2O Oo 也 +oZo 正 +o 工辅群嘲辫一谢荆_ 蝌冁氟i ；i = ? = 7 曩蕊万= ! = 7叱 +oZo 正+oZ配 +o“ 1 -o a l 们+o工比 +oZ( )1 3 + ( )Z比 +U“ r -U Q - + ( ) 工C l e a v e dC a s p a s e 3G A P D HOZ00OU芷。 季蚕宰O -UJ IUZ工I - 。_ _比 +UZo 也+UZ比 UZU I X ,，+oT图7 七氟烷后处理对高脂血症和非高脂血症大鼠缺血I X ,
9、C “ 肌R I S K 信号通路蛋白表达的影响。注：N C ：正常胆固醇血症；H C ：高胆固醇血症；I R ：缺血再灌注；S P C ：七氟烷后处理。各组样本数n = 4 ，+ P 0 0 5 ，V SN C + I R 。o；母1笠IP_o芝堇i。艮叱| + U z皑I + U 工芷| + U Zo；墨odVo毒墨aup a 暑1 3浙江人学硕1 学位论文正文一结论4 讨论本实验结果与先前的研究结果相似，对于在体正常大鼠心脏缺血3 0 m i n 后，再灌注开始时，吸入浓度为1 M A C 的七氟烷可以改善左室血流动力学，减少心肌梗死面积。本实验的结果还表明七氟烷后处理的心肌保护作用通过
10、R I S K 信号通路实现，分别应用P 1 3 K 抑制剂和E R K l 2 抑制剂后其心肌保护作用消失，并且w e s t e r nb l o t 结果表明七氟烷后处理可以上调R I S K 信号通路相关蛋白A k t ，E r k l 2 ，G S K 3p 的磷酸化，上调其抗凋亡效应因子B c l 2 的表达，下调促凋亡蛋白活化C a s p a s e 3的表达。吸入麻醉药后处理可以产生心肌保护作用抑制缺血再灌注损伤，然而很少有研究探讨吸入麻醉药后处理对合并高胆固醇血症个体的心肌影响。在本实验中我们采用8 周的2 胆固醇饮食诱导大鼠的高脂血症形成。H E 染色发现8 周的胆固醇饮
11、食诱导稳定增加的血浆胆固醇水平且没有导致冠状动脉粥样硬化发生【3 4 】，暗示本实验模型影响七氟烷后处理的主要因素是高脂血症本身而非动脉粥样硬化或其他的高胆固醇血症的并发症1 3 5 ，3 6 l 。因此本实验采用本高胆固醇血症模型以研究高胆固醇血症对七氟烷后处理心肌保护效应的影响。我们发现在行心肌缺血再灌注的正常胆固醇血症和高胆固醇血症的大鼠的左心室血流动力学参数无明显差异。采用2 5 0 o 的七氟烷后处理正常胆固醇血症的大鼠产生显著的心肌保护作用，可以降低心肌梗死面积和改善左心室血流动力学参数，上述影响可以被特异性的P 1 3 K 抑制剂和特异性的E r k l 2 阻断剂所逆转。七氟烷
12、后处理的心肌保护效应并没有体现在合并有高胆固醇血症的个体上。进一步的研究发现：七氟烷后处理上调正常胆固醇血症而非高胆固醇血症大鼠的心肌P A k tP E r k l 2 ，P G S K 3p ，B C L 2的表达，下调活化C a s p a s e 一3 表达。然而在高胆固醇血症的个体本身缺血区心肌P - A k tP - E r k l 2 ，P - G S K 3B ，B C L 一2 的表达下降，活化C a s p a s e 一3 表达增加。上述结果表明高胆固醇血症通过影响R I S K 信号通路取消七氟烷后处理的心肌保护作用。众所周知细胞内存在一些激酶信号通路，如磷脂酰肌醇一3
13、 一激酶( P 1 3 K ) 蛋自激酶B ( P K B A k t ) 、P 3 8 、J N K 及细胞外信号调节激酶( E R K l 2 ) 等，称为再灌注1浙江大学硕十学位论文正文一结论损伤补救激酶( R I S K ) 。当细胞发生缺血再灌注损伤时，这些激酶被激活，进而发挥促进细胞存活、抑制细胞凋亡等生物学作用。P 1 3 K A k t 和M A P K E r k l 2 是R I S K途径的两条主要通路。在心肌再灌注损伤中起着极为重要的作用。大量研究表明吸入麻醉药后处理通过激活再灌注损伤补救激酶途径发挥心肌保护作用9 ，3 7 。9 1 。I n a m u r a 等
14、4 0 1 最新研究发现在离体大鼠缺血再灌注模型，七氟烷后处理通过抑制C a s p a s e 3 、9 表达而发挥抗心肌细胞凋亡作用，当同时给予P 1 3 K 阻断剂W o r t m a r m i n时取消了七氟烷后处理对C a s p a s e 一3 、9 的作用，说明七氟烷后处理可能通过A k t磷酸化介导C a s p a s e3 、9 的表达而发挥保护作用。本课题组同仁的实验结果表明：七氟烷后处理上调磷酸化A k t ，B c l 一2 及磷酸化B a d 表达，同时下调B a x 表达。当七氟烷后处理与W o r t m a n n i n 联用时，磷酸化A k t ，B
15、 c l 2 ，磷酸化B a d 表达下降，B a x 表达上调，且与对照组表达水平相当，七氟烷后处理保护作用消失，说明P 1 3 K A k t 信号通路介导七氟烷后处理减轻心肌细胞凋亡的心肌保护作用，七氟烷后处理可能通过激活P 1 3 K A k t 信号通路进一步调节其下游促凋亡及抗凋亡蛋白表达而发挥减轻再灌注心肌细胞凋亡的心肌保护作用。H a u s e n l o y 等f 4 l 】的研究表明E r k l 2 通过调节促凋亡及抗凋亡蛋白表达而参与再灌注损伤诱导的细胞凋亡过程。吸入麻醉药后处理的心肌保护作用与激活E r k l 2 发生磷酸化有关 1 3 , 4 2 - , 1 4
16、 】。I n a m u m等1 4 明研究发现再灌注即刻给予七氟烷后处理2 m i n 可以抑制C a s p a s e3 、9 表达发挥抗细胞凋亡作用，并进一步证明E R K 磷酸化可能作为上游靶蛋白介导C a s p a s e3 、9 的表达。综合上述内容与本实验结果表明，七氟烷后处理激活缺血再灌注心肌R I S K 途径引起下游信号通路蛋白A k t ，E r k l 2 ，G S K 3p 的磷酸化激活，从而促进下游效应因子B c l 2 ，C a s p a s e 3 等蛋白表达变化，从而产生抗心肌缺血再灌注损伤效应。本研究发现，相比非高脂血症个体高脂血症本身可以增加心肌缺血再灌注后的梗死面积。这与以往的研究结果相似。以往的研究表明高胆固醇血症本身而非伴随的动脉粥样硬化是影响药物后处理的主要因素
