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1、 11 附件2发光免疫类检测试剂注册技术审查指导原则2013010420130104一、前言本指导原则主要针对发光免疫类检测试剂的主要原材料、生产工艺及反应体系、产品质量控制等环节提出指导性技术要求。本指导原则系对发光免疫类检测试剂的一般要求，申请人应依据产品特性确定其中的具体内容是否适用，若不适用，需详细阐述其理由及相应的科学依据。本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。本指导原则是在现行法规和标准体系以及
2、当前认知水平下制订的，随着法规和标准的不断完善、科学技术的不断发展，其相关内容也将进行适时的调整。二、适用范围该指导原则主要适用于利用发光免疫分析技术对蛋白质等被测物质进行检测的第三类体外诊断试剂的注册技术审查，第二类试剂的生产及质量控制可参考该指导原则执行三、基本要求（一）基本原则1.研制、生产用的各种原料、辅料应当制定相应的质量标准，并符合有关法规的要求。 12 2.诊断试剂的生产企业应具备相应的专业技术人员、仪器设备以及适宜的生产环境，获得医疗器械生产许可证 ；同时，生产企业应按照体外诊断试剂生产实施细则 （试行） 的要求建立相应的质量管理体系，形成文件和记录，加以实施并保持有效运行；生
3、产企业还应该通过体外诊断试剂生产企业质量管理体系考核评定标准（试行） 的考核。企业应对试剂的使用范围做出明确规定，并经国家药品监督管理部门批准。3.诊断试剂的研制应当按照科学、规范的原则组织研发，各反应条件的选择和确定应符合基本的科学原理。4.研制生产过程中所用的材料及工艺，应充分考虑可能涉及的安全性方面的事宜。5.试剂生产和质量控制的总体目标：保证产品使用安全，质量稳定，工艺可控，使用有效。（二）原材料质量控制1.主要生物原料与产品质量最密切相关的生物原料主要包括各种天然抗原、重组抗原、单克隆抗体、多克隆抗体以及多肽类、激素类等生物原科。这类原料可用于包被酶标反应板、标记相关酶（辣根过氧化物
4、酶、碱性磷酸酶等） 、中和反应用抗原或抗体、制备校准品（标准品）等。一般按工艺要求对这类生物原料进行质量检验，以保证其达到规定的质量标准。主要生物原料若为企业自己生产，其工艺必须相对稳定；若购买，其供应商要求相对固定，不能随意变更供应商，如果主要原料（包括工艺）或其供应商有变更，应依据国家相关法规的要求进行变更申请。主要生物原料的常规检验项目一般包括：（1）外观肉眼观察，大部分生物原料为澄清均一的液体，不含异物、浑浊或 13 摇不散的沉淀或颗粒；或者为白色粉末，不含其他颜色杂质；特殊生物原料应具备相应外观标准。（2）纯度和分子量主要经 SDS-PAGE 电泳后，利用电泳扫描仪进行分析，也可用其
5、他适宜的方法，如高效液相法等。根据所检测生物原料的分子量选择适宜聚丙烯酰胺凝胶浓度进行电泳。一般每个电泳道加样量为 5g，电泳后的凝胶可用考马斯亮蓝染色或银染法染色。染色后的凝胶用电泳扫描仪分析原料的纯度和分子量，纯度应达到相应的质量标准，分子量大小应在正确的条带位置。（3）蛋白浓度蛋白浓度可通过 Lowry 法、 280nm 光吸收法、 双缩脲方法等进行检测。（4）效价效价的测定一般根据蛋白含量测定结果，通过倍比稀释法进行。效价应达到规定的要求。（5）功能性实验功能性实验是指生物原料用于试剂盒实际生产中的情况，一般考查使用该原料的试剂盒的灵敏度、特异性和稳定性等，并比较其与上批次原料的相关性
6、。2.生物辅料生物辅料一般指在生产过程中作为蛋白保护剂用途的一类生物原料、主要包括小牛血清、山羊血清、牛血清白蛋白等。这些生物原料的质量标准应符合 2000 年版的中国生物制品主要原辅材料质控标准 规定的标准要求，并且要适合于本企业的生产。建议作以下检验：（1） 牛血清或羊血清 14 外观：为浅黄色澄清稍粘稠的液体，无溶血或异物无菌试验：将血清直接 37度放置 7 天，放在明亮处观察，不得出现混浊或沉淀。总蛋白含量：用双缩脲法测定，蛋白含量不小于 32mg/ml。球蛋白含量：取待测血清 1ml，采用饱和硫酸铵法进行沉淀，沉淀溶于0.85%氯化钠溶液， 至1ml， 用Lowry方法测定， 蛋白含
7、量应2mg/ml。（2） 牛血清白蛋白：外观：应为浅黄色、黄色或乳白色的冻干粉末，无吸潮，无结块，无肉眼可见的其他杂质颗粒。溶解性：将牛血清白蛋白配成 10%溶液，在 1826时，溶解时间应不大于 15 分钟。1%牛血清白蛋白水溶液的 pH 值应为 6.57.1。总蛋白含量：用双缩脲方测定，质量标准为95。总蛋白中的 BSA 含量：采用硝酸纤维素膜电泳法，其标准为95%。BSA 的净含量：总蛋白含量乘总蛋白中的牛血清白蛋白（BSA）含量，其标准为90%。（3） 酪蛋白：酸度应符合生产所需的质量标准。（4）标记用酶应在产品的质量标准中明示所使用的标记用酶的名称（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）
8、，同时应根据不同生产厂家的检验方法和质量标准进行检验，酶的纯度 RZ 值（OD403nm/OD280nm）应大于 3.0。对于小牛血清或山羊血清、牛血清白蛋白以及酪蛋白等，还应进行功能性实验，即以其为原料配制一定浓度的稀释液作为样品，进行测定，均不得出现非特异性反应。生物辅料的供应商同样要求相对固定，不得随意变更供应商。 15 3.化学原材料化学原材料的质量标准，包括外观、一般盐类检测、溶液 pH 值、 重金属检测、溶解情况、干燥失重、炽灼残渣等，均应符合中国生物制品主要原辅材料质控标准（2000 年版） 分析纯级别的要求，并且要适合于本企业的生产。（1）无机类：主要包括有氯化钠、磷酸氢二钠、
9、磷酸二氯钠等。（2）有机类：主要包括有吐温 20、三羟基氨基甲烷等。（3）特殊化学原料：铕-DTTA，鲁米诺等。铕-DTTA 纯度分析与鉴定：要求铕-DTTA 各功能团符合分子结构， 纯度在 96%以上。4.其他原辅料（1）微孔板条外观：明亮处用肉眼观察板条的外观质量应无划痕、破损、飞边、肮脏、表面光滑。板条与微孔反应条塑料框架应配合合适。材质：微孔反应板条每孔加 200L 增强液，用发光免疫分析仪检测其荧光值，平均本底荧光值1500。吸附能力和精密性：用一定浓度的蛋白包被微孔板条，检测荧光值，CV 值结果应符合相关产品的功能性质量标准，一般批内 CV5,批间CV10。（2）其他粘胶纸、铝箔袋
10、、说明书、包装外盒、瓶子和干燥剂等应参照国家食品药品监督管理局发布的 体外诊断试剂说明书编写指导原则 和 医疗器械说明书、标签和包装标识管理规定建立相应质量控制标准。（三）试剂盒各组分的生产发光免疫分析试剂主要组分的生产包括包被反应板、标记物制备、 16 各种溶液的配置、冻干、分包装等步骤；并通过产品的半成品检验和成品检验两个质控过程来保证其质量符合规定。1.固相载体的制备（因不同产品使用的包被载体有很大区别，在此以标准 96 孔微孔反应板为例进行描述）（1）包被板的准备准备经检验合格的包被板，记录批号、数目、状态标识。质控项目：尺寸、外观、包装。（2）包被液的配制配制包被缓冲液，加入包被的抗
11、体或抗原至工作浓度，混合均匀，即成所需的包被液，工作浓度的包被液应在规定时间内使用。质控项目：包被缓冲液配方、pH 值、包被物成分。（3）包被板的包被包被液按工艺要求加入包被板。记录所包被的包被板数量。质控项目：包被体积、温度、时间、过程监控。（4）洗板工作液的配制（按各单位工艺要求，可以不洗板）按配方配制洗板工作液。质控项目：洗板工作液配方、pH 值。（5）封闭液的配制按配方配制封闭液。质控项目：封闭液配方、pH 值。（6）洗板和封闭包被完成后，抽去孔内包被液，用洗板工作液洗板后（按各单位工艺要求，可以不洗板） ，加入封闭液。质控项目：封闭体积、温度、时间、过程监控。质检项目：封闭前检验包被
12、均一性。 17 （7）抽干封闭后的反应板，抽干孔内液体。质控项目：过程监控。（8）干燥反应板应按工艺的要求进行干燥。质控项目：温度、湿度、时间、过程监控等。（9）密封包装将干燥后的反应板用铝箔袋密封包装，内放干燥剂（按各单位工艺要求，可以不放） 。质控项目：密封性能、标示及效期等。（10）反应板（半成品）检验对装袋密封后的反应板进行抽样检验，外观、板内变异、板间变异。2.滴配过程（1）酶结合物的制备（根据各产品实际情况，该步骤可不进行）采用常规过碘酸钠乙二醇法将相关的抗体（或抗原）标记辣根过氧化物酶（或其他酶） ，酶标记后的抗体（或抗原）应加入适当的保护剂保存于低温。质控项目：标记方法、过程控
13、制。（2）酶结合物的鉴定功能性实验将酶结合物用酶稀释液稀释后，用于产品的滴配，其结果应符合相关试剂盒的质量标准。 稳定性将酶结合物用酶稀释液稀释，进行 28热稳定性实验，滴配结果应符合相关试剂盒的质量标准。 18 （3）酶结合物稀释液按酶结合物稀释液的配方配制，存放在 28保存，并于规定时间内使用。质控项目：酶结合物稀释液配方、pH 值。（4）酶结合物工作浓度的滴配取酶结合物，用酶结合物稀释液稀释到不同的浓度，用已制备好的反应板进行滴配。测定系列标准品及相应的质控品，确定使体系达到最优的酶结合物工作浓度。（5）酶结合物工作液配制将所需量酶结合物和酶结合物稀释液按滴配浓度混合均匀。质检项目：分装
14、前检验，用配套的反应板进行检验，外观、灵敏度、质控品测定值、定量产品应作校准品线性检测。（6）酶结合物工作液的分装按工艺要求分装酶结合物工作液。质控项目：分装前确认试剂名称、批号、数量，分装量，封装后密封性。（7）酶结合物工作液（半成品）检验对分装后的酶结合物工作液进行抽样检验，外观、分装量、灵敏度、校准品剂量-反应曲线线性、质控品测定值。3. 校准品、阴/阳性对照或质控品的制备（1）稀释液按稀释液的配方配制， 存放在 28或-20保存， 并于有效期内使用。质控项目：稀释液配方、pH 值。（2）校准品、阴/阳性对照或质控品的配制校准品、阴/阳性对照或质控品的配制应具有量值溯源性，可参照国 19
15、 家标准品、世界卫生组织标准品或其他级别的标准物质进行配制。质检项目： 分装前检验， 准确性、 剂量反应曲线线性 （定量产品） 、质控品测定值。（3）校准品、阴/阳性对照或质控品的分装按工艺要求分装校准品、阴/阳性对照或质控品。质控项目：分装前确认试剂名称、批号、数量，分装量。（4）校准品、阴/阳性对照或质控品（半成品）检验对分装后的校准品、阴/阳性对照或质控品进行抽样检验，外观、 分装量、准确性、剂量反应曲线线性（定量产品） 、质控品测定值。4.化学发光底物的制备（1）底物缓冲液按底物缓冲液的配方配制，存放在 28保存，并于有效期内使用。质控项目：底物缓冲液配方、pH 值。（2）化学发光底物
16、（氧化剂和发光剂）的配制分别按氧化剂和发光剂的配方在底物缓冲液中加入相应的氧化剂和发光剂质控项目：氧化剂和发光剂配方。质检项目：分装前检验，本底、发光强度。（3）化学发光底物（氧化剂和发光剂）的分装按工艺要求分装化学发光底物（氧化剂和发光剂） 。质控项目：分装前确认试剂名称、批号、数量，分装量，封装后密封性。（4）化学发光底物（半成品）检验对分装后的化学发光底物进行抽样检验，外观、分装量、本底、灵敏度、发光强度。5.铕标记物的制备 20 针对不同的标记生物原料，确定不同的标记制备工艺，包括铕-DTTA与标记生物原料的比例，标记温度和标记时间、标记得率的计算标准等。在实际操作过程中要求严格按照标准操作规程进行操作6.冻干各种冻干品都需建立各自的冻干工艺，冻干品外观应该呈现疏松的粉末状固体，具有一定的形状，复溶完全、迅速，呈澄清透明液体。7.分装、灯检和贴签分装量用减重称量法进行测量，把质量换算成体积后进行分装量的控制。灯检是目测检查各组分的色泽、分装量以及是
