发酵工程产物的提取与精制

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1、第十二章第十二章 产物的提取与精制产物的提取与精制 第一节第一节 概论概论 一、下游加工过程在发酵工程中的地位一、下游加工过程在发酵工程中的地位 1，下游加工过程的定义发酵产品系通过微生物发酵过程、酶反应过程或动植物细胞大量培养获得。从 上述发酵液、反应液或培养液中分离、精制有关产品的过程称为下游加工过程 (Down stream processing)。它由一些化学工程的单几操作组成，但由于生物物质的 特性，有其特殊要求，而且其中某些单元操作一般化学工业中应用较少。 2，地位 传统发酵工业(如抗生素、乙醇、柠檬酸)，分离和精制部份占整个工厂投资费 用的 60%。对重组 DNA 发酵、精制蛋白

2、质的费用可占整个生产费用的 80%90%。二、发酵下游加工过程的特点二、发酵下游加工过程的特点 培养液(或发酵液)是复杂的多相系统，含有细胞、代谢产物和末用完的培养基 等。分散在其中的固体和胶状物质，具可压缩性，其密度又和液体相近，加上粘度 很大，属非牛顿性液体，使从培养液中分离固体很困难。 培养液中所欲欲提取的生物物质浓度很低，但杂质含量却很高，特别是利用基 因工程方法产生的蛋白质常常伴有大量性质相近的杂质蛋白质。 另一个特点是欲提取的生物物质通常很不稳定、遇热、极端 pH、有机溶剂会 引起失活或分解。 发酵或培养都是分批操作、生物变异性大，各批发酵液不尽相同，要求下游加 工有一定的弹性。三

3、、分离过程的机理与分离操作三、分离过程的机理与分离操作 1，物理性质 （1）力学性质：重力、离心力、筛分； （2）热力学性质：状态变化、相平衡； （3）传质性质：粘度、扩散、热扩散； （4）电磁性质：电泳、电渗析、磁化； 2，化学性质 （1）化学热力学；化学平衡； （2）反应动力学：反应速率； （3）光化学性质：激光激发、离子化； 3，生物学性质 （1）分子识别：生物亲和作用、生物学识别； （2）输送性质：生物膜输送； （3）反应、响应、控制：酶反应、免疫系统。生物操作机理及其分离机理 单元操作分离机理分离对象举例 膜分离 微滤超滤反渗透透析电渗析渗透气化压力差、筛分 压力差、筛分 压力差、筛

4、分 浓度差、筛分 电荷、筛分 汽液相平衡、筛分菌体、细胞 蛋白质、多糖、抗生素 糖、氨基酸 盐、蛋白质 氨基酸、有机酸 乙醇 萃取 有机溶剂萃取双水相液膜萃取反胶团萃取超临界萃取液液相平衡 液液相平衡 液液相平衡 液液相平衡 相平衡有机酸、抗生素 蛋白质、抗生素 氨基酸、有机酸、抗生素 氨基酸、蛋白质 香料、脂质 层析 凝胶过滤层析反相层析离子交换层析亲和层析疏水相互作用层析聚焦浓度差、筛分 分配平衡 电荷、浓度差生物亲和作用 疏水作用 电荷、浓度差脱盐、分子分级 甾醇、维生素、肽 蛋白质、氨基酸、抗生素、 核酸、有机酸 蛋白质、核酸 蛋白质 蛋白质 电泳 凝胶电泳等电点电泳等速电泳区带电泳筛

5、分、电荷 筛分、电荷、浓度差 筛分、电荷、浓度差 筛分、电荷、浓度差蛋白质、核酸 蛋白质、氨基酸 蛋白质、氨基酸 蛋白质、核酸 离心 离心过滤离心沉降超离心离心力、筛分 离心力 离心力菌体、菌体碎片 菌体、细胞 蛋白质、核酸、糖类四、发酵工业下游技术的一般工艺过程四、发酵工业下游技术的一般工艺过程 下游加工过程由各种化工单元操作组成。由于生物产品品种多，性质各异，故 用到的单元操作很多，其中如蒸馏、萃取、结晶、吸附、蒸发和干燥等属传统的单 元操作，理论比较成熟，而另一些则为新近发展起来的单元操作，如细胞破碎、膜 过程和色层分离等，缺乏完整的理论，介于两者之间的有离子交换过程等。 1， 一般工艺

6、过程 一般说来，下游加工过程可分为 4 个阶段：培养液(发酵液)的预处理和固液分离； 初步纯化(提取)；高度纯化(精制)；成品加工。2，工艺过程的划分： 发酵的下游加工过程可以下过程： （1）预处理和固液分离 ：目的是除去发酵液中的菌体细胞和不溶性固体杂质。（2）初步分离 ：目的是除去与产物性质差异较大的杂质，为后道精制工序创 造有利条件。 （3）高度纯化 ：去除与产物的物理化学性质比较接近的杂质。 （4）成品制作 ：成品形式由产品的最终用途决定。 3，选择下游加工工艺的原则： （1）是胞内产物还是胞外产物 （2）原料中产物和主要杂质浓度 （3）产物和主要杂质的物理化学特性及差异 （4）产品用

7、途和质量标准 （5）产品的市场价格 （6）废液的处理方法等 第二节第二节 发酵液的预处理和固液分离发酵液的预处理和固液分离 发酵液预处理和固液分离的目的：分离菌体和其他悬浮颗粒(细胞碎片、核酸 和蛋白质的沉淀物)；除去部分可溶性杂质和改变滤液性质，以利于提取和精制的 顺利进行。一、一、 发酵液的预处理发酵液的预处理 采用理化方法设法增大虚浮液中固体粒子的大小、或降低粘度，以利于过滤。 去除会影响后续提取的高价无机离子。 （一）预处理的方法 高价无机离子的去除方法； 杂蛋白质的去除； 发酵液的凝聚和絮凝。 1，高价无机离子的去除方法 （1）钙离子，可用草酸。草酸溶解度较小，故用量大时，可用其可溶

8、性盐， 如草酸钠。反应生成的草酸钙还能促使蛋白质凝固，提高滤液(也称为原液)质量。 但草酸价格较贵，应注意回收。如四环类抗生素废液中，加入硫酸铅，在 60下 反应生成草酸铅。后者在 9095下用硫酸分解，经过滤、冷却、结晶后可以回收 草酸。 （2）镁离子，可用三聚磷酸钠它和镁离子形成可溶性络合物，用磷酸盐处理， 也能大大降低钙离子和镁离子的浓度。此法可用于环丝氨酸的提取。 （3）铁离子，可加入黄血盐，使形成普鲁士蓝沉淀。 2，杂蛋白质的去除方法 （1）热变性 （2）沉淀 （3）大幅度改变 pH3，发酵液的凝聚和絮凝 凝聚和絮凝的概念，过去常常混淆，现已趋于明确区分开来。凝聚是在中性盐 作用下，

9、由于双电层排斥电位的降低，而使胶体体系不稳定的现象。絮凝是指在某 些高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使胶粒形成粗大的絮凝团的过程，是一种 以物理的集合为主的过程。 （1）机理 电解质将胶体粒子表面上的电荷中和，减少存在于胶体粒子间的静电斥力，使 伦敦范德华(LondonVander waals)吸引力占优势，这样胶体就会凝聚成较大、较 密实的粒子，或在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使胶粒形成粗大的絮 凝团使之更容易过滤。（2）方法 在稀溶液中加入电解质以促进凝聚和絮凝。试剂包括酸、碱、简单电解质和合 成的高分子电解质。 （3）常用的絮凝剂 聚丙烯酰胺、聚乙烯亚胺、聚胺衍生物、氯化钙、

10、磷酸氢二钠 （4）影响絮凝的因素 虽然絮凝的机理目前还不十分清楚，但是已知道絮凝效果与絮凝剂的加量、分 子量和类型，溶液的 pH，搅拌速度和时间等因素有关。 在絮凝过程中，常需加入一定的助凝剂以增加絮凝效果。料液中，絮凝剂浓度 增加有助于架桥充分，但是过多的加量反而会引起吸附饱和，在每个胶粒上形成覆 盖层而使胶粒产生再次稳定现象。如淀粉酶发酵液的絮凝试验中，絮凝剂加量对絮凝效果(滤速)的影响如下图所示。适宜的加量通常由实验得出，虽然高分子絮凝剂 分子量提高，链增长，可使架桥效果明显，但是，分子量不能超过一定的限度，因 为随分子量提高，高分子絮凝 剂的水溶性降低，因此分子量的选择应适当溶液 pH

11、 的变化常会影响离子型絮凝剂中功能团的电离度，从而影响分子链的 伸展形态。电离度增大，由于链节上相邻离子基团间的电排斥作用，而使分子链从 卷曲状态变为伸展状态，所以架桥能力提高。例如，采用碱式氯化铝和阴离子聚丙 烯酰胺搭配使用的混凝方法处理 2709 碱性蛋白酶发酵液，发酵液 pH 对阴离子聚 丙烯酰胺絮凝效果的影响如下图所示。可见 pH 适当提高能增大滤速，这是因为聚 丙烯酰胺分子链上的羧基解离程度提高，而使其达到较大的伸展程度，发挥了最佳 的架桥能力。絮凝技术预处理发酵液的优点不仅在于过滤速度的提高，还在于能有效地去除 杂蛋白质和固体杂质，如菌体、细胞和细胞碎片等，提高了滤液质量二、二、

12、发酵液的过滤发酵液的过滤 微生物发酵液中含有大量菌体、细胞或细胞碎片以及残余的固体培养基成分。 过滤就是将悬浮在发酵液中的固体颗粒与液体进行分离的过程。 在过滤操作中，要求滤速快，滤液澄清并且有高的收率。 1，影响过滤速度的因素 过滤速度和以下因素有关 菌种； 发酵条件（培养基的组成、未用完培养基的数量、消沫油、发酵周期、 ） 。 （1）菌种对过滤速度影响 真菌的菌丝比较粗大，如青霉菌的菌丝直径可达 10m，发酵液容易过滤，不 需特殊处理。其滤渣呈紧密饼状物，很容易从滤布上刮下来，故可采用鼓式真空过 滤机过滤。 放线菌发酵液菌丝细而分枝，交织成网络状。如链霉素发酵液菌丝仅 0.51.0m 左右

13、，还含有很多多糖类物质，粘性强，过滤较困难，一般需经预处理， 以凝固蛋白质等胶体。 细菌发酵液的菌体更细小，因此，过滤十分因准，如不用絮凝等方法预处理发 酵液，往往难以采用常规过滤的设备来完成过滤操作。 （2）培养基的组成对过滤速度影响 用黄豆粉、花生粉作氮源、淀粉作碳源会使过滤困难； 发酵后期加消泡油或剩余大量末用完的培养基也会使过滤困难。 （3）发酵周期对过滤的影响 正确选择发酵终了时间对过滤影响很大。在菌体丝自溶前必须放罐，因为细胞 自治后的 分解产物一股很难过滤。有时延长发酵周期虽能使发酵单位有所提高， 但严重影响发酵液质量，使色素和胶状杂质增多、过滤困难，最终造成成品质量降 低。 2

14、，改善过滤性能的方法 发酵工业中用于改善发酵液过滤性能的方法通常有：等电点、蛋白质变性、吸 附、凝聚和絮凝、加入助滤剂、直接在发酵液中形成填充-凝固剂、酶解作用。 （1）过滤助剂 助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒，它能使滤饼疏松，滤速增大。 过滤助剂可解决两个问题 滤饼的可压缩性问题 小粒子如菌丝碎片和细菌细胞，会渗入到转鼓真空过滤预覆盖层内部。使得 预覆盖层的部分孔被堵塞，影响了渗透性。加入助滤剂可以解决这一问题 常用的过滤助剂有：硅藻土、珍珠岩、磨碎的木浆、淀粉 助滤剂的加入有两种方法： 在滤布上预先铺一层助滤剂(12mm)，该方法，会使滤速降低，但滤液透明 度 直接加入发酵液中（助滤剂的用

15、量，有一条经验规则可供参考，即助滤剂用 量若等于悬浮液中固体含量时，滤速最快。 ） 。（2）填充-凝固剂改善过滤性能较好的方法是加入一些反应剂，它们能相互作用，或和某些溶解 性盐类发生反应生成不溶解的沉淀(CaSO4，AlPO4等)。生成的沉淀能防止菌丝体 粘结，使菌丝具有块状结构，沉淀本身即可作为助滤剂，并且还能使胶状物和悬浮 物凝固，如新生霉素发酵液中加入氯化钙和磷酸钠，生成的磷酸钙可作为填充-凝 固剂。一方面作为助滤剂，另一方面还可使某些蛋白质凝固。又如环丝氨酸发酵液 用氧化钙和磷酸处理，生成的磷酸钙沉淀，能使悬浮物凝固。多余的磷酸根离子， 还能除去钙、镁离子。并且在发酵液中不会引入其它

16、阳离子而影环环丝氨酸的离子 交换吸附。正确选择反应剂和反应条件，能使过滤速度提高 310 倍。 （3）酶解作用 如发酵液中有不溶解的多糖存在则最好用酶将它转化为单糖，以提高过滤速度。 例如万古霉素用淀粉作培养基，加入淀粉酶后，能使过滤速度加快。 3，固-液分离设备的选择 不同性状约发酵液应选择不同的固-液分离设备。常用于发酵液的分离设备有： 板框压滤机、鼓式真空过滤机、离心沉降分离机 （1）板框压滤机 板框压滤机的过滤面积大，过滤推动力(压力差)能较大幅度地进行调整，并能 耐受较高的压力差，故对不同过滤特性的发酵液适应性强，同时还具有结构简单， 价格低，动力消耗少等优点，因此，目前，国内广泛被采用。但是，这种设备不能 连续操作，设备笨重，劳动强度大，卫生条件差，非生产的辅助时间长(包括卸框、 卸饼、洗滤饼，洗滤布，重新压紧板框等)，阻碍了过滤效率的提高。自动板框过 滤机是一种较新型的压滤设备，它使板框的拆装，滤渣的脱落卸出和滤布的清洗等 操作都能自动进行，大大缩短了非生产的辅助时间和减轻了劳动强度。对于菌体较 细小