《光谱分析幻灯》由会员分享，可在线阅读，更多相关《光谱分析幻灯（68页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、 光谱分析Spectral Analysis医学实验技术基础光谱分析的概念 利用各种化学物质（包括原子、 基团、分子及高分子化合物）所具 有的发射、吸收或散射光谱系的特 征，来确定其性质、结构或含量的 技术，称为光谱分析技术。 电 磁 波 谱区 域波 长射线10-3-0.1 nm X射线0.1-10 nm 远紫外10-200 nm 紫外200-400 nm 可见400-760 nm 红外0.76-50 m 远红 外50-1000 m 微波0.1-100 cm 无线电 波1-1000 m光谱分析的分类吸收光谱分析发射光谱分析散射光谱分析可见光及紫外光分光光度法原子吸收分光光度法红外分光光度法荧光
2、分析法火焰光度法比浊法光学检测仪器的种类比色计 紫外可见光分光光度计 红外分光光度计 荧光分光光度计 原子吸收分光光度计 核磁共振波谱仪 质谱仪第一节 紫外可见光分光光度法 （吸收光谱分析法 ）本节拟探讨的主要内容 紫外吸收光谱的产生 紫外光谱中常用的术语 紫外光谱测定方法 影响紫外吸收光谱的因素 紫外可见分光光度计的结构 紫外可见分光光度计的应用什么是紫外可见光分光光度法？紫外可见光分光光度法是根据物质分 子对紫外光及可见光光谱区辐射的吸收 特征和吸收程度，对物质进行定性和定 量分析的一种吸收光谱法。（一）紫外可见光吸收光谱的产生紫外可见吸收光谱是由于分子中电子跃迁产生的。电子跃迁需要能量，
3、波长在100-800nm的光线才有足够的能量引起电子的跃迁，其中近紫外区（200-400nm）较为重要。当用能量接近于电子能级跃迁的紫外光和可见光照射物质分子时，伴随分子的振动和电子能级的变化，产生紫外可见吸收光谱。吸收光谱与分子结构的关系特定分子中的电子跃迁所需能量与 分子的内部结构有关； 分子吸收谱线形状仅取决分子的内 部结构； 不同物质由于结构上的差异所需的 跃迁能量也不同，于是出现不同的 特征吸收谱线。 *n*n*n，成键轨道； * ，反键轨道；，成键轨道； *， 反键轨道；n，非成键轨道（电子对未共用）基态激发态, 吸收一定频率的辐射能量产生共振吸收线（简称共振线） 吸收光谱各种电子
4、跃迁基态激发态吸收光谱示意图发色团： 能在紫外及可见光范围内产生吸收，具有不饱和未 共用电子对的基团，称为发色团。可引起n*、 *、 n* 等电子跃迁。例如：CC、NO 等基团。 助色团： 助色团是一些具有非共价键的基团（如OH、NH2、 SH等）。这些基团在波长200 nm处没有吸收，当它 与发色团相连接时，这些基团上的未共用电子对与发 色团的不饱和键相互作用，进而导致发色团的特征吸 收带向长波方向移动，且能增大吸收强度。（二）基本术语基本术语红移 某些有机化合物的结构中引入含有未共 用电子对的基团时，其原有发色团的吸 收峰会向长波移动，称为红移（或浅色 效应）。 兰移某些基团与发色团连接时
5、，使吸收波长 向短波移动的现象，称为兰移（或深色 效应）。光谱测定中的两个数据透光度（T）均匀吸收介质的透过光的比例，也叫 透射比。 T=I/Io吸光度（A）(光密度OD）均匀吸收介质透光度的倒数的对数。A=lg (1/T) =lg（Io/I）朗伯-比尔定律（Lambert-Beer）:一定波长（单色光）时，某溶液的吸光度 与该溶液的浓度和液层的厚度的乘积成正 比.即: A=LCL:用厘米表示,C：用摩尔/升来表示。为摩尔吸光系数,相当于L=1cm，C=1mol/L，在一 定波长下的吸光度。其值取决于入射光的波长、溶 液的温度和性质。（三）光学理论依据（四）分析方法标准曲线法：将一系列浓度不同
6、的标 准溶液按照一定操作过程显色后，分 别测吸光度，以吸光度为纵坐标，浓 度为横坐标绘制标准曲线。在相同条件下处理待测物质并测 定其吸光度，即可从标准曲线找出相 对应的浓度。 2. 对比法：将标准样品与待测样品在相 同条件下显色并测定各自的吸光度。 由于测定体系温度、厚度以及入射光 波长是一致的，所以经比较计算待测 样品浓度。 常用分析方法3. 差示法：有色溶液浓度太浓或太稀 （透光度超过90%-10%）时，测定 结果会产生较大误差，此时可采用 差示法。 4. 利用摩尔吸光系数进行检测（朗伯- 比尔定律） 常用分析方法例：尿嘧啶核苷酸溶液用1cm石英吸收池测定 260nm处的吸光度为0.650
7、，用同一吸收池测定纯 溶剂的吸光度为0.070，计算尿嘧啶溶液的摩尔浓 度，已知其摩尔吸光系数=8.2103 。 A LC A（溶剂加样品的吸光度）（溶剂的吸光度） A0.6500.0700.580 L1cm C7.1105 mol / L 分析举例（五）影响因素共轭体系的存在，使max红移。 结构中不饱和键的数目影响被测分子的光吸收 能力，改变最大吸收峰（max） 。异构现象（互变异构及几何异构）。 大部分有机化合物都存在异构现象（双键移动 ），异构体的吸收光谱差异很大。 空间效应导致光谱的max红移。 如：CH3I 258nm CH2I2 289nm CHI3 349nm基团取代的影响。
8、取代基团的性质及基团在分子中的相对位置。样品溶液中pH对光谱的影响。 影响电子的配对及键的强弱。溶剂对紫外光谱的影响。 原因：溶剂间氢键的形成、浓度、极性。 当溶剂从非极性变成极性时，吸收光谱会变 的平滑，精细结构消失。 极性增加时，溶剂之间易形成氢键，使最大 吸收峰（max）蓝移。影响因素紫外吸收光谱分析对溶剂的要求尽量选用低极性溶剂。溶剂在样品的吸收光谱区无明显吸收。能很好的溶解被测物，并且形成的溶液 具有良好的化学和光学稳定性。（六）紫外可见分光光度计的类型1.单光束简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光 度，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具 有很高的稳定性。主要适于定
9、量分析。2.双光束自动记录，快速全波段扫描。可消除光源不稳定、 检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分 析。仪器复杂，价格较高。紫外可见分光光度计的类型3.双波长将不同波长的两束单色光(1、2， =12nm) 快速交替通过同一吸收池而后到达检测器，产生交流信 号。无需参比池。光源单色器样品室检测器显示1. 光源在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具 有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。可见光区：钨灯作 为光源，其辐射波长范 围在3202500 nm。紫外区：氢、氘灯 ，发射185400 nm的 连续光谱。（七）紫外可见光分光光度计的结构2.单色器将光源发射的复合光分
10、解成单色光并可从中选出一任波长单色光的光学系统。入射狭缝：光源的光由此进入单色器；准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束； 色散元件：将复合光分解成单色光；棱镜或光栅；聚焦装置：透镜或凹面反射镜，将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝；出射狭缝。紫外可见光分光光度计的结构3. 样品室（吸收池）样品室放置各种类型的吸收池 （比色皿）和相应的池架附件。吸 收池主要有石英池和玻璃池两种。 在紫外区须采用石英池，可见区一 般用玻璃池。4. 检测器利用光电效应将透过吸收池的 光信号变成可测的电信号，常用的 有光电池、光电管或光电倍增管。紫外可见光分光光度计的结构5. 结果显示记录系统检流计、数字显示、微机
11、进行 仪器自动控制和结果处理。紫外可见光分光光度计的结构（八）使用分光光度计的注意事项分光光度计必须放置在固定且不受振动的仪器台上， 不能随意搬动，严防振动、潮湿和强光直射。比色杯盛液量以达到杯容积的2/3左右为宜。不可用手拿比色杯的光学面，禁止用毛刷等物摩擦比 色杯的光滑面。比色杯用完后要立即用去离子水冲洗。仪器连续使用时间不应该超过两小时，每次使用后需 要间歇半小时以上。每套分光光度计上的比色杯及比色槽不得随意更换。可以用来研究分子的结构，并进行定 性和定量分析。 物质纯度； 结构测定； 异构体的确定； 氢键强度的测定； 有机化合物含量的测定； 酶的分析。（九）紫外可见分光光度计的应用1.
12、核酸的定量核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能。可 以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA， 以及RNA。核酸最高吸收峰的吸收波长：260 nm。1OD 的吸光值分别相当于： 50g/ml 的dsDNA 37g/ml 的ssDNA 40g/ml 的RNA 30g/ml 的Olig 应用2.比色法蛋白质定量 比色方法一般有BCA，Bradford，Lowry 等几种方 法 Lowry 法 ：蛋白质与Cu2+反应，产生蓝色的反应物 。 BCA（Bicinchoninine acid assay）法：要分析的 蛋白在碱性溶液里与Cu2+反应产生Cu+，后者与 BCA形成螯合物，形成紫色化合
13、物，吸收峰在 562nm波长。 Bradford 法：蛋白质与考马斯亮兰结合反应，产生的有色化合物吸收峰595nm。 应用3.细菌细胞密度（OD 600） OD600是追踪液体培养物中微生物生长 的标准方法。 测试的样品不能离心，保持细菌悬浮状 态。 应用第二节显色与测量条件的选择（一）显色反应的选择直接显色反应：灵敏度高、选择性高、生成 物稳定； 氧化还原显色反应：某些元素的氧化态在紫 外或可见光区有强烈的光吸收，因而可利用 氧化还原反应对待测元素进行显色测定。如 Mn2+；配位显色反应：金属离子与有机显色剂形成 配合物时，通常会发生电荷转移跃迁，产生 很强的紫外-可见吸收光谱。（二）显色剂
14、无机显色剂：硫氰酸盐、钼酸铵、过氧化氢 等几种。有机显色剂：种类繁多。偶氮类显色剂：本身是有色物质，生成配合 物后，颜色发生明显变化。具有显色反应灵 敏度高、性质稳定、选择性好、对比度大等 优点，应用广泛。 三苯甲烷类：铬天青S、二甲酚橙等。1.显色剂用量吸光度A与显色剂用量CR的关系会出现如 图所示的几种情况。选择曲线变化平坦处。（三）显色反应条件的选择2.反应体系的酸度在相同实验条件下，分别测定不同pH值条件下显色溶液的吸光度。选择曲线中吸光度 较大且恒定的平坦区所对应的pH范围。 3.显色时间与温度实验确定4.溶剂一般尽量采用水相测定。显色反应条件的选择（四）测定条件的选择1.选择适当的
15、入射波长一般应该选择max为 入射光波长。如果max处有共存组 分干扰时，则应考虑选择 灵敏度稍低但能避免干扰 的入射光波长。2.选择合适的参比溶液 为什么需要使用参比溶液？ 使测得的吸光度尽可能真实地反映待测溶液吸光强度。（四）测定条件的选择3.控制适宜的吸光度（读数范围）样品池中液体的组成：待测样品+溶剂+其它反应试剂+显色剂参比溶液的选择一般遵循以下原则：（1） 若仅待测组分与显色剂的反应产物在测定波长处有吸收，其它所加试剂均无吸 收，用纯溶剂（水)作参比溶液；（2） 若其它所加试剂在测定波长处略有吸 收，而待测液本身无吸收，用“试剂空白 ”(不加待测溶液)作参比溶液；（四）测定条件的选择 若待测试液在测定波长处有吸收，而显色剂等无吸收，则可用“试样空白”(不加显色剂)作参比溶液； 若显色剂、试液中其它组分在测量波长处有吸收，则可在试液中加入适当掩蔽剂将待测组分掩蔽后再加显色剂，作为参比溶液。（四）测定条件的选择第三节原子吸收分光光度法 （一）概念原子吸收光光度法是基于元素所产生的原子蒸 气中，待测元素的基态原子，对所发射的特征 谱线的吸收作用进行定量分析的一种技术。 具有灵敏度高、选择性好、操作简便、分析速 度快等优点，对大部分元素，其灵敏度约为10-810-10g/ml。是微量元素检测的
