《高表达ILK对大鼠BMSCs增殖及生长因子表达水平的影响》由会员分享，可在线阅读，更多相关《高表达ILK对大鼠BMSCs增殖及生长因子表达水平的影响（52页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、南京大学硕士研究生论文原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南京大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献己在论文中作了说明并表示感谢。作者签名：专艮弗日期：妇I 心且- 日关于学位论文使用授权说明本人了解南京大学有关保留、使用学位论文的规定，即学校有权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文；学校可根据国家或江苏省有关部门规定
2、送交学位论文。作者签名：。专勋菩导师签名：日期：弘H 年6 月上日南京大学硕士研究生论文目录I 、中文摘要52 、英文摘要73 、缩略词表94 、高表达I L K 对大鼠B M S C s 增殖及生长因子表达水平的影响引言1 2材料与方法1 3结果2 4：讨论3 1结论34参考文献：3 55 、文献综述骨髓间充质干细胞治疗与急性心肌梗死后左室重构4 0参考文献4 76 、致谢5 27 、附录攻读硕士学位期间发表的文章5 3南京大学硕士研究生论文壹室盘堂盟塞生望些逾塞主塞擅璺萱夏旦箜毕业论文题目：高盘垫! 坠圣壁盘氢墅墨g 墨擅堕盈生益固主盘鲨查的受响：兰垒篁疸堂专业2Q Q 墨级硕士生姓名：高
3、丝主指导教师( 姓名、职称) ：盆盘熬授目的：骨髓间充质干细胞( B o n em a r r o wm e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ，B M S C s ) 是一类具有增殖和分化为心肌样细胞潜能的成体干细胞。它在心肌梗死和终末期心力衰竭的治疗上可能有较大的潜能。一些研究表明，B M S C s 细胞移植的治疗作用主要与其自分泌和旁分泌作用有关；但是这种作用相对较弱，而且由于移植的B M S C s 很快凋亡所以作用维持时间很短。整合素连接激酶( i n t e g r i n li n k e dk i n a s e ，I L K ) 是广泛存在
4、在很多组织和细胞中的一种丝氨酸蛋白激酶，其高表达具有促进细胞增殖和增加细胞因子表达的作用。本研究采用全骨髓贴壁法分离培养出B M S C s ，研究转染腺病毒介导的整合素连接激酶对大鼠骨髓间充质干细胞增殖及一些生长因子的表达水平的影响，目的是寻找改善B M S C 功能的可能方法，为其临床应用提供理论和实践基础。方法：构建携带人野生型I L K 质粒a D N A 和重组绿色荧光蛋白( h r G F P ) 的腺病毒载体( a d e n o - I L K ) 和空载腺病毒；通过全骨髓贴壁法分离培养B M S C s 。采用无血清培养转染a d e n o - I L K ( M S C
5、- I L K 组) 或空载腺病毒( M S C 组) ，通过流式细胞术检测h r G F P 从而测定转染效率，确定最佳的病毒感染复数( M O I ) 。采用E D U 法测定其增殖率；提取两组B M S C sm R N A 及蛋白质，予W e s t e r nb l o t t i n g 检测I L K蛋白的表达情况，R e a l t i m eP C R 检测V E G F 、F G F 一2 和I G F 一1 基因表达量。E L I S A检测两组B M S C s 培养液中V E G F 浓度。结果：M S C 组增殖率为0 2 3 2 0 0 1 2 ，M S C I
6、L K 组增殖率为0 3 1 6 0 0 1 5 ( P 9 9 B M S C s 死亡口1 。M a n g i 等研究发现，移植被A k t 转基因修饰的B M S C s 到心肌梗死模型的大鼠心肌中，2 周后能明显抑制心肌梗死后心室重构，且心功能几乎恢复正常H 1 ；G n e c c h i 等随后研究发现心肌梗死大鼠的心功能恢复发生在7 2 小时内，这主要归因于A k t 基因能促进B M S C s 分泌V E G F 、F G F - 2 、H G F 与I G F - I 等细胞因子口1 。整合素连接激酶( I L K ) 是整合素依赖的通路中关键性的组成之一，是一种广泛分布
7、的胞浆S e r T h r 蛋白激酶，在跨膜信号传导中起着重要作用，调节着细胞的粘附、生存、分化和凋亡，在哺乳动物多种细胞中均有表达，包括结肠、乳腺、肺、肝、心、胰腺、骨骼肌、软骨细胞、淋巴细胞、巨噬细胞和血小板等哺3 ，同时具有促进细胞增殖的作用。我们猜测工L K 一作为A k t 因子上游通路，亦能促进B M S C s 分泌上述因子及促进B M S C s增殖。本研究即是通过体外转染I L K 基因来探讨其对B M S C s 的增殖及旁分泌作用的影响。1 夕南京大学硕士研究生论文材料与方法实验材料1 实验动物S P F 级S D 大鼠，雌雄不分，4 - 6 周龄，平均体重l O O
8、g 左右，由鼓楼医院动物实验中心提供。2 实验仪器及设备( 1 ) 超净工作台：A I R T E C H ，苏州中亚净化设备有限公司。( 2 ) 台式高速低温离心机：B i o f u g e s t r a t o s 公司。( 3 ) 光学显微镜：O l y m p u s 公司。( 4 ) 流式细胞仪：F A C S C a l i b u r ，B D 公司。( 5 ) 3 7 。C ，5 C 0 2 饱和湿度恒温培养箱：H e r a e u s 公司。( 6 ) 垂直平板电泳及转移装置：B i o - R a d 公司。( 7 ) 水平式琼脂糖电泳设备：B i o R a d 公
9、司。( 9 ) D 1 型自动蒸汽灭菌锅：北京发恩科贸有限公司。( 1 0 ) 超低温冰箱：T h e r m o 公司。( 1 1 ) 电子天平：梅特勒一托利多仪器上海有限公司。( 1 2 ) 微型漩涡混合仪：I R A 公司。( 1 3 ) D - 1 型自动蒸汽灭菌锅：北京发恩科贸有限公司。( 1 4 ) 超纯水净化器：D e i o n i z a t i o n ，M i i i i p o r e 公司。( 1 5 ) 消毒线剪、组织剪、镊子、血管钳、无菌培养皿、1 5 m l 离心管、5 0 m l 离心管、吸管、2 5 c m 2 培养瓶、细胞计数板、6 孔板、各种型号微量移液
10、器、移液枪头、酒精灯、冷冻保存管、试管架、火柴、记号笔、5 m l 无菌注射器、l O m l 无菌注射器、保鲜膜，封口胶、冰盒、计时器、手套等。( 1 6 ) 稳压电源：B i o - R a d 公司。( 1 7 ) 荧光倒置相差显微镜：O l y m p u s 公司。南京大学硕士研究生论文( 1 8 ) S c o t c h - B r i t e 海绵垫：B i o R a d 公司。( 1 9 ) W h a t m a n3m m 滤纸：B i o - R a d 公司。( 2 0 ) 自动医用胶片冲洗机：柯尼卡公司。( 2 1 ) 聚偏氟乙烯( P V D F ) 膜：M i
11、 l l i p o r e 公司。( 2 2 ) 9 6 孔酶标仪：S U N D R I S E 公司。( 2 3 ) A B IP R I S M7 5 0 0F a s t r e a l t i m eR C RS y s t e m 。( 2 4 ) D - 1 型自动蒸汽灭菌锅：北京发恩科贸有限公司。3 实验药品及试剂 ( 1 ) 胎牛血清F B S ：G I B C O ，美国。( 2 ) 0 2 5 胰酶( 含0 0 2 E D T A ) ：G I B C O ，美国。( 3 ) L G - D M E M ：G I B C O ，美国。( 4 ) 磷酸盐缓冲液P B S
12、：G I B C O ，美国。( 5 ) G F P 标记的携带有人野生型I L Ke D N A 的腺病毒载体：上海英骏生物技术有限公司。( 6 ) 空载腺病毒组( 上海英骏生物技术有限公司) 。( 7 ) 小鼠抗人I L K 抗体1 ：3 0 0 0 ，肋T r a n s d u c t i o nL a b o r a t o r i e s 。( 8 ) H R P 标记羊抗小鼠二抗( I g G1 ：i 0 0 0 0 ，S a n t aC r u zB i o t e c h n o l o g y ) 。( 9 ) S Y B RP r e m i xE x 尼矿I I 试剂
13、盒( T a K a R a 公司，大连) 。( 1 0 ) F I T C - C D 3 4 ( B DB i o s c i e n c e 公司) 。( 1 1 ) F I T C - C D 4 4 ( B DB i o s c i e n c e 公司) 。( 1 2 ) F I T C - C D 4 5 ( B DB i o s c i e n c e 公司) 。( 1 3 ) C D 2 9 - P E ( B DB i o s c i e n c e 公司) 。( 1 4 ) M M L V 逆转录酶( i n v i t r o g e n ，美国)( 1 5 ) 青霉素
14、：山东鲁抗医药有限公司。( 1 6 ) 链霉素：华北制药股份有限公司。( 1 7 ) C l i c k i T E d UA l e x aF l u o r 5 5 5 ：( i n v i t r o g e n ，美国)( 1 8 ) R a tV E G FQ u a n t i k i n eE L I S AK i t ：( R & D ，美国)4 实验试剂配制1 4南京大学硕士研究生论文( 1 ) 0 0 1 M ，P H 7 4 的P B S 溶液的制备：N a C l ：8 0 9 ；K C l ：0 2 9 ；N a 2 H P 0 4 ：1 4 4 9 ：K H 2 P
15、 0 4 ：0 2 4 9 ；溶至8 0 0 m l 蒸馏水中，用H C l 调整至P H 7 4 ，最后定容至1 0 0 0 m l 。( 2 ) T r i s 缓冲液( T r i s H C lb u f f e r ) 的配置：将1 2 1 9 的T r i s 碱溶解于0 9 L 水中，再根据所要求的P H ( 2 5 “ C ) 加一定量的浓盐酸，用水调整终体积至1 0 0 0 m l 。( 3 ) R I P A ( 蛋白提取液) 配方：1 MT r i SH C lP H 7 2l m l ；N a C l0 8 7 7 5 9 ；0 5 ME D T Al m l ：T r i t o n 一1 0 0原液l m l ；脱氧胆酸钠l g ；I O S D Sl m l ；d d H 。08 0 m l ；溶解后定容至l O O m l ，分装后4 保存。( 4 ) 青霉素：8 0 万单位支+ 4 m lN S 或P B S = 2 0 万单位m l ，无菌
