蛋白质-1 [兼容模式]

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1、肽肽肽肽-蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构氨基酸通过肽键聚合形成蛋白质的结构骨架氨基酸通过肽键聚合形成蛋白质的结构骨架肽的特征肽的特征一、一、肽的特征肽的特征二二、天然存在的活性肽天然存在的活性肽二二、天然存在的活性肽天然存在的活性肽三、蛋白质序列分析三、蛋白质序列分析四、肽合成的方式四、肽合成的方式蛋白质的结构层次蛋白质的结构层次蛋白质的结构层次蛋白质的结构层次一、肽键的特征一、肽键的特征一、肽键的特征一、肽键的特征L-氨基酸通过肽键连接形成肽（氨基酸通过肽键连接形成肽（Peptide）a肽键肽键Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu氨基酸残基氨基酸残基氨基酸

2、残基氨基酸残基(amino acid residue): 肽链中的每个氨基酸。肽链中的每个氨基酸。残基残基指一个氨基酸成肽失指一个氨基酸成肽失去去H O后的部分后的部分。去去H2O后的部分后的部分。肽单位肽单位20 世纪世纪30 年代后期，年代后期，Linus Paulin 和和Robert Corey 用用X 射线衍射法分析氨基酸和肽的精确结构射线衍射法分析氨基酸和肽的精确结构，并预并预用用X-射线衍射法分析氨基酸和肽的精确结构射线衍射法分析氨基酸和肽的精确结构，并预并预测蛋白质的构象，重要发现之一是确定了肽单位。测蛋白质的构象，重要发现之一是确定了肽单位。肽单位肽单位(peptidegro

3、up):是多肽链中从一个是多肽链中从一个-碳原子碳原子到相邻到相邻碳原子之间的结构碳原子之间的结构。肽单位的构象具有肽单位的构象具有三三到相邻到相邻-碳原子之间的结构碳原子之间的结构。肽单位的构象具有肽单位的构象具有三三个个显著的特征。显著的特征。肽单位的肽单位的三个三个显著特征：显著特征：1肽单位是一个刚性的平面结构1肽单位是一个刚性的平面结构肽键中羰基碳原子与氮原子之间所形成的键不能肽键中羰基碳原子与氮原子之间所形成的键不能自由旋转自由旋转，这个这个C-N 键长键长=0 132nm自由旋转自由旋转，这个这个C-N 键长键长 0.132nm一般一般C-N 单键单键=0.147nm一般一般单键

4、单键一般一般C=N双键双键=0.127nm所以具有所以具有部分双键部分双键(40%)性质，性质，不能自由旋转不能自由旋转，这，这使得肽单位所包含的六个原子处于同一个平面上使得肽单位所包含的六个原子处于同一个平面上，使得肽单位所包含的六个原子处于同一个平面上使得肽单位所包含的六个原子处于同一个平面上，这个平面又称为这个平面又称为酰胺平面（酰胺平面（amide plane）或肽平面）或肽平面（）。（peptide plane）。肽单位的六个原子处于同肽单位的六个原子处于同一一平面平面肽单位的六个原子处于同平面肽单位的六个原子处于同平面22肽平面中羰肽平面中羰基基氧与氧与亚亚氨氨基基氢大多氢大多处于

5、相反处于相反位位置置肽平面中羰氧与氨氢大多位肽平面中羰氧与氨氢大多位理论理论: 顺式和反式顺式和反式实际实际: 反式反式实际实际: 反式反式原因原因 相邻两个相邻两个碳上的侧链基团间立体干扰碳上的侧链基团间立体干扰原因原因: 相邻两个相邻两个-碳上的侧链基团间立体干扰碳上的侧链基团间立体干扰Pro羰基氧与亚氨基氢大多处于相反位置(Pro除外)羰基氧与亚氨基氢大多处于相反位置(Pro除外)3C和和-NH的的N、C和和-CO的的Co之间是单键之间是单键，可自由旋转可自由旋转 C N键旋转的角度为键旋转的角度为phi( )。3C和和 NH的的N、C和和 CO的的Co之间是单键之间是单键，可自由旋转可

6、自由旋转 C-N键旋转的角度为键旋转的角度为phi()。 C -C 键旋转的角度为键旋转的角度为psi()。 C-Co键旋转的角度为键旋转的角度为psi()。 和和所在的平面称为所在的平面称为C原子的二原子的二和和 所在的平面称为所在的平面称为原子的二原子的二面 角面 角(dihedral angle)或或肽单位二面肽单位二面角角。其理论上可在其理论上可在0180内变动内变动，角角。其理论上可在其理论上可在0180内变动内变动，但但R基团的限制，使基团的限制，使和和的变动的变动不是随意的。不是随意的。Gly受的限制最小，受的限制最小，P受的限制最大受的限制最大。Pro受的限制最大受的限制最大。

7、若两个肽链侧面相连，若两个肽链侧面相连， C在同一平面在同一平面，此时此时和和必必在同一平面在同一平面，此时此时和和必必定为定为0。这种蛋白质构象是。这种蛋白质构象是不存在的，因为不存在的，因为-COOH的的O和和 NH 的的H立体重了立体重了O和和-NH2的的H立体重了立体重了.肽的分类肽的分类:二肽二肽(Dipeptides):由由2 个氨基酸缩合形成的肽。个氨基酸缩合形成的肽。寡肽寡肽(oligopeptide):1220个氨基酸残基的肽链。个氨基酸残基的肽链。多肽多肽(polypeptide):2050个氨基酸残基的肽个氨基酸残基的肽。多肽多肽(polypeptide):2050个氨基

8、酸残基的肽个氨基酸残基的肽。蛋白质蛋白质：个以上氨基酸组成个以上氨基酸组成。蛋白质蛋白质 (protein)：50个以上氨基酸组成个以上氨基酸组成。氨基酸的平均相对分子量为氨基酸的平均相对分子量为110110 ？20种种AA平均分子量平均分子量 138氨基酸的平均相对分子量为氨基酸的平均相对分子量为110110 ？20种种AA平均分子量平均分子量138蛋白质中多为小氨基酸蛋白质中多为小氨基酸 平均分子量平均分子量 128蛋白质中多为小氨基酸蛋白质中多为小氨基酸, 平均分子量平均分子量128形成形成1个肽健去除个肽健去除1H O分子量分子量 18形成形成1个肽健去除个肽健去除1H2O分子量分子量

9、=18平均分子量平均分子量。AA平均分子量平均分子量128-18=110。一般蛋白质含有一般蛋白质含有个氨基酸个氨基酸。故分子量为故分子量为一般蛋白质含有一般蛋白质含有502 000 个氨基酸个氨基酸。故分子量为故分子量为5500220000。5500220000。各种蛋白质的分子量大小不各种蛋白质的分子量大小不一一各种蛋白质的分子量大小不各种蛋白质的分子量大小不细胞色素细胞色素c c细胞色素细胞色素c c肌红蛋白肌红蛋白肌红蛋白肌红蛋白血红蛋白血红蛋白胰岛素胰岛素胰岛素胰岛素细胞色素细胞色素c核酶肌红蛋白溶解酵素核酶肌红蛋白溶解酵素血红蛋白血红蛋白免疫球蛋白谷氨酸合成酶免疫球蛋白谷氨酸合成酶

10、各种蛋白质的大小各种蛋白质的大小牛细胞色素牛细胞色素C牛胰凝乳蛋白酶原牛胰凝乳蛋白酶原牛细胞色素牛细胞色素C C牛细胞色素牛细胞色素和和牛胰凝乳蛋白酶原牛胰凝乳蛋白酶原的多肽链各有其特定的氨的多肽链各有其特定的氨基酸组成基酸组成基酸组成基酸组成肽的书写：肽的书写：甘 丙 丝 缬 亮 蛋 赖 赖 精 谷甘 丙 丝 缬 亮 蛋 赖 赖 精 谷.Gly-Ala-Ser-Val-Leu-Met-Lys-Lys-Arg-GluG-A-S-V-L-M-K-K-R-E肽的化学性质与氨基酸相似，但因肽的化学性质与氨基酸相似，但因-氨基和氨基和羧基已经缩合羧基已经缩合，所以各氨基酸残基的所以各氨基酸残基的R侧侧

11、-羧基已经缩合羧基已经缩合，所以各氨基酸残基的所以各氨基酸残基的R侧侧链对肽的性质的影响就更加突出。链对肽的性质的影响就更加突出。另外，肽的呈色反应也和氨基酸相似。另外，肽的呈色反应也和氨基酸相似。在讨论单个多肽链时，蛋白质和多肽这两个术语可以互换。在讨论单个多肽链时，蛋白质和多肽这两个术语可以互换。蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质(protein):广泛的定义是含有一条或多条肽链。广泛的定义是含有一条或多条肽链。单体蛋白单体蛋白单体蛋白单体蛋白(monomeric protein):只含只含一条一条多肽链。多肽链。多聚体蛋白多聚体蛋白多聚体蛋白多聚体蛋白(multimeric protein):含含

12、一条以上一条以上的多肽链。的多肽链。同型多聚体同型多聚体同型多聚体同型多聚体(homomultimeric):蛋白中只含蛋白中只含一种一种多肽链多肽链同型多聚体同型多聚体同型多聚体同型多聚体(homomultimeric):蛋白中只含蛋白中只含一种一种多肽链多肽链。异型多聚体异型多聚体异型多聚体异型多聚体(heteromultimeric):蛋白中含蛋白中含不同不同的多肽链。的多肽链。同型二聚体同型二聚体同型二聚体同型二聚体(homodimer):两条两条相同相同的多肽链亚基的多肽链亚基(subunits)组组成的二聚体成的二聚体成的二聚体成的二聚体。异型二聚体异型二聚体异型二聚体异型二聚体(

13、heterodimer):两条两条不同不同的多肽链亚基的多肽链亚基(subunits)组组成的二聚体。成的二聚体。二、天然存在的活性肽二、天然存在的活性肽二、天然存在的活性肽二、天然存在的活性肽活性肽活性肽(active peptide)：存在于生物体内，具各存在于生物体内，具各种特殊生物学功能的肽种特殊生物学功能的肽。种特殊生物学功能的肽种特殊生物学功能的肽。 GSH（谷胱甘肽）（谷胱甘肽）医学上重要的肽医学上重要的肽-肽键肽键GluCysGlyGSH分子中有一个特殊的分子中有一个特殊的-肽键肽键，是由谷氨酸的，是由谷氨酸的-羧基与半胱氨酸的羧基与半胱氨酸的-氨基缩合而成的氨基缩合而成的，这

14、与蛋这与蛋 羧基与半胱氨酸的羧基与半胱氨酸的 氨基缩合而成的氨基缩合而成的，这与蛋这与蛋白质分子中的白质分子中的肽键不同。肽键不同。谷胱甘肽还原酶谷胱甘肽还原酶GSH功能功能GSH功能功能： 解毒功能解毒功能：SH基团可和致癌剂基团可和致癌剂、药物结合药物结合，避避 解毒功能解毒功能：SH基团可和致癌剂基团可和致癌剂、药物结合药物结合，避避免体内免体内RNA、DNA和蛋白质受损和蛋白质受损。免体内免体内、和蛋白质受损和蛋白质受损。 还原剂还原剂：维持红细胞膜的完整性。：维持红细胞膜的完整性。 参与许多蛋白质和多肽的二硫键的形成参与许多蛋白质和多肽的二硫键的形成。 参与许多蛋白质和多肽的二硫键的

15、形成参与许多蛋白质和多肽的二硫键的形成。 参与维生素的代谢过程参与维生素的代谢过程。 参与维生素的代谢过程参与维生素的代谢过程。 是一些酶发挥作用所必需的辅助因子。是一些酶发挥作用所必需的辅助因子。上的上的 ，在谷光甘肽过氧化酶的催化下在谷光甘肽过氧化酶的催化下，能能 GSH上的上的H，在谷光甘肽过氧化酶的催化下在谷光甘肽过氧化酶的催化下，能能还原细胞内产生的还原细胞内产生的H2O2，使其变为使其变为H2O。还原细胞内产生的还原细胞内产生的H2O2，使其变为使其变为H2O。短杆菌肽S短杆菌肽S有些肽链是环状结构，没有游离的羧基端和氨基端。有些肽链是环状结构，没有游离的羧基端和氨基端。如毒蘑菇中

16、存在的如毒蘑菇中存在的 鵝鵝膏蕈碱膏蕈碱是一个环状是一个环状8 肽肽，它能它能如毒蘑菇中存在的如毒蘑菇中存在的-鵝鵝膏蕈碱膏蕈碱是一个环状是一个环状8 肽肽，它能它能抑制真核抑制真核RNA聚合酶的活性，从而抑制聚合酶的活性，从而抑制RNA的合成，的合成，导致机体死亡导致机体死亡。导致机体死亡导致机体死亡。Orn短杆菌肽短杆菌肽S作为激素的肽作为激素的肽下列都是具有激素作用的多肽。下列都是具有激素作用的多肽。三、蛋白质序列分析：一级结构的测定三、蛋白质序列分析：一级结构的测定三、蛋白质序列分析：一级结构的测定三、蛋白质序列分析：一级结构的测定1. 1. 一级结构不同导致蛋白质功能不同一级结构不同

17、导致蛋白质功能不同一级结构不同导致蛋白质功能不同一级结构不同导致蛋白质功能不同其氨基酸序列是阐明该蛋白质生物活性的分子基础其氨基酸序列是阐明该蛋白质生物活性的分子基础其氨基酸序列是阐明该蛋白质生物活性的分子基础其氨基酸序列是阐明该蛋白质生物活性的分子基础2. 2. 一一级结构级结构一一级结构级结构的关键部分相同则功能相同的关键部分相同则功能相同的关键部分相同则功能相同的关键部分相同则功能相同同源蛋白质同源蛋白质：2. 2. 级结构级结构级结构级结构的关键部分相同则功能相同的关键部分相同则功能相同的关键部分相同则功能相同的关键部分相同则功能相同同源蛋白质同源蛋白质：在不同有机体中实现同一功能的蛋

18、白质。在不同有机体中实现同一功能的蛋白质。如如：电子传递链中的细胞色素电子传递链中的细胞色素C C、血红蛋白等血红蛋白等。如如：电子传递链中的细胞色素电子传递链中的细胞色素C C、血红蛋白等血红蛋白等。序列同源性：序列同源性：不同种属来源的同源蛋白质中氨基酸的序列相不同种属来源的同源蛋白质中氨基酸的序列相似似。似似。不变残基：不变残基：蛋白质生物活性所必需的氨基酸残蛋白质生物活性所必需的氨基酸残基基。基基。可变残基可变残基：氨基酸的改变对蛋白质功能无影响氨基酸的改变对蛋白质功能无影响。可变残基可变残基：氨基酸的改变对蛋白质功能无影响氨基酸的改变对蛋白质功能无影响。细胞色素细胞色素C是一个小蛋白

19、，是一个小蛋白，包含一条多肽链。包含一条多肽链。陆地脊椎动物陆地脊椎动物：104 AA陆地脊椎动物陆地脊椎动物：104 AA鱼：鱼：103 or 104 AA昆虫昆虫：107AA昆虫昆虫：107 AA真菌和酵母：真菌和酵母：107 to 109 AA绿色植物：绿色植物：111 or 112 AA分析了分析了40种不同的物种，种不同的物种，发现发现28种氨基酸是不变的种氨基酸是不变的。发现发现28种氨基酸是不变的种氨基酸是不变的。在在14、17位置位置，都有都有Cys，在在14、17位置位置，都有都有Cys，连接血红素辅基。连接血红素辅基。7080的不变残基串，可的不变残基串，可能是与酶结合的部

20、位。能是与酶结合的部位。不同物种的细胞色素不同物种的细胞色素C中不同氨基酸数目的比较中不同氨基酸数目的比较不同物种的细胞色素不同物种的细胞色素C中不同氨基酸数目的比较中不同氨基酸数目的比较2005 9 1: Nat re 封面文章封面文章2005-9-1: Nature 封面文章封面文章2005-9-1: Science 封面文章封面文章报道报道:美、以、德、意、西共美、以、德、意、西共67名科学家完成名科学家完成黑猩猩基因组序列草图黑猩猩基因组序列草图黑猩猩和人类基因组的序列相似性达到黑猩猩和人类基因组的序列相似性达到99人类只比黑猩猩多人类只比黑猩猩多个特殊基因个特殊基因人类只比黑猩猩多人

21、类只比黑猩猩多50个特殊基因个特殊基因有有29%的共同基因编码生成同样的蛋白质的共同基因编码生成同样的蛋白质有有29%的共同基因编码生成同样的蛋白质的共同基因编码生成同样的蛋白质美国国立生物技术信息中心美国国立生物技术信息中心(NCBI)网址：网址：Htpp:/www.ncbi.nlm.nih.gov人类和他们的祖先细胞色素人类和他们的祖先细胞色素C的比较的比较根据不同物种的细胞色素根据不同物种的细胞色素C序列差异建立的进化树序列差异建立的进化树3: 3: 同源蛋白质具有共同的进化起源同源蛋白质具有共同的进化起源同源蛋白质具有共同的进化起源同源蛋白质具有共同的进化起源例子：肌红蛋白与血红蛋白例

22、子：肌红蛋白与血红蛋白肌红蛋白肌红蛋白：是肌肉的氧合血红素蛋白是肌肉的氧合血红素蛋白，是一条是一条肌红蛋白肌红蛋白：是肌肉的氧合血红素蛋白是肌肉的氧合血红素蛋白，是一条是一条153153个氨基酸残基的多肽链个氨基酸残基的多肽链。153153个氨基酸残基的多肽链个氨基酸残基的多肽链。血红蛋白:血红蛋白:是红细胞的氧转运蛋白，由两条链是红细胞的氧转运蛋白，由两条链和两条和两条链组成的四聚体链组成的四聚体。和两条和两条链组成的四聚体链组成的四聚体。肌红蛋白肌红蛋白、血红蛋白的血红蛋白的链和链和链都是珠蛋白链都是珠蛋白，肌红蛋白肌红蛋白、血红蛋白的血红蛋白的链和链和链都是珠蛋白链都是珠蛋白，它们的序列

23、具有部分同源性。它们的序列具有部分同源性。人红蛋白人红蛋白珠蛋白链和珠蛋白链和珠蛋白链的序列性珠蛋白链的序列性人人肌肌红蛋白红蛋白、-珠蛋白链和珠蛋白链和-珠蛋白链的序列珠蛋白链的序列同源同源性性4 4 蛋白质级结构的测定蛋白质级结构的测定蛋白质级结构的测定蛋白质级结构的测定4. 4. 蛋白质蛋白质一一级结构的测定蛋白质级结构的测定蛋白质一一级结构的测定级结构的测定(1) 蛋白质的酸解蛋白质的酸解(1) 蛋白质的酸解蛋白质的酸解蛋白质的肽键可被蛋白质的肽键可被强酸强酸或或强碱强碱水解。酸解对某些氨水解。酸解对某些氨基酸基酸(Ser、Thr、Arg和和Cys)的损伤比碱处理小。的损伤比碱处理小。

24、 酸解条件酸解条件6M HCL 1100C 24 72 h 酸解条件酸解条件: 6M HCL, 1100C, 2472 hr 破坏严重：破坏严重：Trp和和Cys。py 慢慢破坏：慢慢破坏：Ser和和Thr 慢慢水解慢慢水解：V l和和Il 慢慢水解慢慢水解：Val和和Ile 脱酰胺作用脱酰胺作用：Gln和和Asn，分别形成分别形成Glu和和Asp脱酰胺作用脱酰胺作用：和和，分别形成分别形成和和p蛋白质的酸解过程中不同氨基酸的情况蛋白质的酸解过程中不同氨基酸的情况(2)牛胰岛素牛胰岛素-第一个被测定的多肽第一个被测定的多肽( )1953年，年，Frederick Sanger完成。完成。牛胰岛

25、素是牛胰脏中胰岛牛胰岛素是牛胰脏中胰岛细胞所分泌的一种调节糖代细胞所分泌的一种调节糖代牛胰岛素是牛胰脏中胰岛牛胰岛素是牛胰脏中胰岛-细胞所分泌的一种调节糖代细胞所分泌的一种调节糖代谢的蛋白质激素，是一种多肽。 有抗炎、抗动脉硬化、谢的蛋白质激素，是一种多肽。 有抗炎、抗动脉硬化、抗血小板聚集抗血小板聚集、治疗骨质增生治疗骨质增生、治疗精神疾病等作用治疗精神疾病等作用。抗血小板聚集抗血小板聚集、治疗骨质增生治疗骨质增生、治疗精神疾病等作用治疗精神疾病等作用。牛胰岛素的牛胰岛素的牛胰岛素的牛胰岛素的氨基酸序列氨基酸序列（51AA）（51 AA）The Nobel Prize in Chemistr

26、y 1958“for his work on the structure of proteinsfor his work on the structure of proteins, especially that of insulin.”Frederick SanFrederick Sang gererBackground Born:August 13 1918g gBorn: August 13, 1918Place of Birth: Rendcombe, Gloucestershire, England,gResidence: Great BritainAffiliation: Camb

27、ridge University 牛胰岛素分子量为牛胰岛素分子量为5734（51 AA）A和和B两条多肽链，之间以两条多肽链，之间以S-S相连。相连。A链链: 21AA和一个链内和一个链内S-SB链链: 30AA通用的氨基酸测序策略包括七个基本步骤：通用的氨基酸测序策略包括七个基本步骤：通用的氨基酸测序策略包括七个基本步骤：通用的氨基酸测序策略包括七个基本步骤：Step1: 如蛋白质含有如蛋白质含有一一条以上的多肽链条以上的多肽链，首先将首先将Step1: 如蛋白质含有条以上的多肽链如蛋白质含有条以上的多肽链，首先将首先将肽链拆分和纯化。肽链拆分和纯化。处理：极端处理：极端pH，8M尿素、尿素

28、、6M的盐酸胍或高盐。的盐酸胍或高盐。结果：打断蛋白质分子内和蛋白质与溶剂之间的结果：打断蛋白质分子内和蛋白质与溶剂之间的氢 键，消除分子的极性。氢 键，消除分子的极性。Step2: 二硫键的打断二硫键的打断过甲酸氧化法过甲酸氧化法巯基化合物还原法巯基化合物还原法（1）过甲酸）过甲酸氧化法氧化法：二硫键二硫键氧化氧化断裂后，使断裂后，使Cys残基的侧链带上电残基的侧链带上电离基离基，静电排斥二硫键的重新形成静电排斥二硫键的重新形成。离基离基SO3-，静电排斥二硫键的重新形成静电排斥二硫键的重新形成。过甲酸过甲酸过甲酸法使二硫键氧化断裂过甲酸法使二硫键氧化断裂过甲酸法使二硫键氧化断裂过甲酸法使二

29、硫键氧化断裂（2）巯基化合物巯基化合物还原法还原法：（2）巯基化合物巯基化合物还原法还原法：用过量的用过量的-巯基乙醇巯基乙醇（或二硫苏糖醇或二硫苏糖醇）处理处理用过量的用过量的 巯基乙醇巯基乙醇（或二硫苏糖醇或二硫苏糖醇）处理处理（pH8-9,室温放置数小时），可使室温放置数小时），可使S-S定量还定量还原为原为。原为原为-SH。烷化剂：烷化剂：碘乙酸碘乙酸或或溴丙胺溴丙胺作用作用：保护保护Cys中的中的-SH，以防以防S-S的重新生成的重新生成。作用作用：保护保护Cys中的中的-SH，以防以防S-S的重新生成的重新生成。巯基乙醇巯基乙醇碘乙酸碘乙酸烷化烷化碘乙酸碘乙酸溴丙胺溴丙胺Step3

30、: 分析氨基酸的组成分析氨基酸的组成见酸水解部分见酸水解部分Step4: N端和端和C端的氨基酸残基的确定端的氨基酸残基的确定N端氨基酸残基的鉴定端氨基酸残基的鉴定N端氨基酸残基的鉴定端氨基酸残基的鉴定:A. Edman 降解法降解法也叫也叫异硫氰酸苯酯异硫氰酸苯酯 (PITC)A. Edman 降解法降解法也叫也叫异硫氰酸苯酯异硫氰酸苯酯 (PITC)该法较优越，可连续鉴定该法较优越，可连续鉴定N端的一系列残基。端的一系列残基。以弱碱以弱碱PITC为试剂，以为试剂，以PTH-氨 基酸氨 基酸 (UV区有区有强吸收强吸收)鉴定氨基端的氨基酸残基。鉴定氨基端的氨基酸残基。已根据其原理设计制造出氨

31、基酸自动分析仪。已根据其原理设计制造出氨基酸自动分析仪。已内酰苯硫脲已内酰苯硫脲转化反应转化反应异硫氰酸苯酯异硫氰酸苯酯1 mol/L HCL三氟乙酸三氟乙酸苯乙内酰硫脲氨基酸苯乙内酰硫脲氨基酸(PTH-氨基酸)有UV吸(PTH-氨基酸)有UV吸pH9三氟乙酸三氟乙酸收,层析、质谱法鉴定收,层析、质谱法鉴定偶联反应偶联反应环化断裂反应环化断裂反应个个残的肽残的肽偶联反应偶联反应环化断裂反应环化断裂反应PTC-肽少一肽少一个个aa残残基基的肽的肽Edman 降解法降解法(I)可循环可循环异硫氰酸苯酯异硫氰酸苯酯异硫氰酸苯酯异硫氰酸苯酯苯氨基硫甲酰肽（苯氨基硫甲酰肽（PTC肽）肽）苯乙内酰硫脲丙氨

32、酸苯乙内酰硫脲丙氨酸Edman 降解法例子降解法例子EdmanEdman 降解法降解法( (II)II)- -氨基酸自动分析仪的设计原理氨基酸自动分析仪的设计原理EdmanEdman 降解法降解法( (II)II) 氨基酸自动分析仪的设计原理氨基酸自动分析仪的设计原理B. 丹磺酰氯丹磺酰氯(DNS-Cl)法法：由：由Maram及及Gilbert研究组建立研究组建立()具荧光具荧光丹磺酰氯丹磺酰氯(DNS-Cl)法法灵敏度高灵敏度高丹磺酰氯丹磺酰氯(DNS Cl)法图示法图示丹磺酰氯丹磺酰氯(DNS-Cl)法图示法图示C. 2,4-二硝基苯二硝基苯(FDNB or DNFB)法法：Sanger研

33、究组建立研究组建立。C. 2,4 二硝基苯二硝基苯(FDNB or DNFB)法法：Sanger研究组建立研究组建立。黄色黄色黄色黄色FDNB法法（简略表示简略表示）：）：FDNB法法（简略表示简略表示）：）：(1)(2)(3)(4)(5)(6) 标记标记(1)(2)(3)(4)(5)(6) 标记标记(1)(2)(3)(4)(5)(6) 水解水解(1) (2) (3) (4) (5) (6)( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( )三三种方法比较种方法比较种方法比较种方法比较名称名称结构结构产物产物备注备注名称名称结构结构产物产物备注备注2,4-二二硝基硝基 氟苯氟苯肽的肽的黄色黄色硝基硝

34、基,硝基硝基 氟苯氟苯(FDNB)肽的肽的黄色黄色硝基硝基苯衍生物从肽链上水解苯衍生物从肽链上水解新生成的新生成的N-末末丹磺酰氯强丹磺酰氯强荧光荧光磺酰胺磺酰胺衍生物衍生物新生成的新生成的N 末末端产物，破坏其它肽键。端产物，破坏其它肽键。(DNS-Cl)衍生物衍生物异硫氰酸苯酯异硫氰酸苯酯(Edman-PITC)PTH-氨基酸，PTH-氨基酸，UVUV避免上述缺点避免上述缺点(Edman PITC)异硫氰异硫氰酸苯酯酸苯酯酸苯酯酸苯酯测定小肽序列的步骤测定小肽序列的步骤C端氨基酸残基的鉴定端氨基酸残基的鉴定C端氨基酸残基的鉴定端氨基酸残基的鉴定:化学法化学法肼解法肼解法化学法化学法-肼解法

35、肼解法多肽多肽无水肼无水肼(NH2NH2)aa-NH2NH2 + aaCOO-1000C， 510h氨基酸酰肼游离碳末端氨基酸酰肼游离碳末端氨基酸酰肼氨基酸酰肼 + 苯甲醛苯甲醛二苯基衍生物二苯基衍生物水相中游离水相中游离C端的端的AA + FDNB 黄色化合物黄色化合物黄色化合物黄色化合物肼肼肼肼苯甲醛苯甲醛C 末端分析末端分析肼解法肼解法C-末端分析末端分析肼解法肼解法羧肽酶法羧肽酶法测定肽链测定肽链C端残基端残基的常用方法。由肽链外切酶的常用方法。由肽链外切酶专一专一地从地从C端开始端开始逐个降解逐个降解，释放出游离氨基酸释放出游离氨基酸，有有A、地从地从C端开始端开始逐个降解逐个降解，

36、释放出游离氨基酸释放出游离氨基酸，有有A、B、C、Y四种羧肽酶。四种羧肽酶。酶来源羧基端作用部位酶来源羧基端作用部位羧肽酶羧肽酶A小牛胰腺除小牛胰腺除Arg、Lys、Pro羧肽酶羧肽酶猪胰腺猪胰腺羧肽酶羧肽酶B猪胰腺猪胰腺Arg 、Lys羧肽酶羧肽酶C柑桔叶子柑桔叶子所有所有AA羧肽酶羧肽酶C柑桔叶子柑桔叶子所有所有AA羧肽酶羧肽酶Y酵母酵母所有所有AA羧肽酶羧肽酶Y酵母酵母所有所有AAStep5 ：将多：将多肽肽特异地裂解成较小的特异地裂解成较小的肽肽p肽肽肽肽化学法：溴化氰及无水溴化氰化学法：溴化氰及无水溴化氰(CNBr)(CNBr)高度特异地分别作用于高度特异地分别作用于Met残基t残基

37、羧基侧羧基侧肽键肽键总反应总反应总反应总反应CNBr高丝氨酸内酯高丝氨酸内酯高丝氨酸内酯高丝氨酸内酯酶解法：酶解法：胰蛋白酶胰蛋白酶胰蛋白酶的作用位点胰蛋白酶的作用位点酶或试剂水解位置酶或试剂水解位置EdmanEdman降解降解肽链肽链N N端氨基酸的羧基侧端氨基酸的羧基侧EdmanEdman降解降解肽链肽链N N端氨基酸的羧基侧端氨基酸的羧基侧/PITC/DNS-Cl /PITC/DNS-Cl 胰蛋白酶胰蛋白酶LysLys、ArgArg （C C）,(,(高度特异高度特异, ,之后是之后是ProPro除外除外) )胰蛋白酶胰蛋白酶LysLys、ArgArg （C C）,(,(高度特异高度特异

38、, ,之后是之后是ProPro除外除外) )胰凝乳蛋白酶Phe、Trp、Tyr 胰凝乳蛋白酶Phe、Trp、Tyr （C）（C）,Leu、Met或His次之(糜蛋白酶) ,Leu、Met或His次之(糜蛋白酶) 胃蛋白酶Phe、Trp、Tyr、Leu、Asp、Glu胃蛋白酶Phe、Trp、Tyr、Leu、Asp、Glu（N）（N）嗜热菌蛋白酶Leu、Ile、Val嗜热菌蛋白酶Leu、Ile、Val（N）（N）SaSa蛋白酶蛋白酶GluGlu、AspAsp （C C）SaSa蛋白酶蛋白酶GluGlu、AspAsp （C C）Fm蛋白酶Pro Fm蛋白酶Pro （C）（C）PfPf蛋白酶蛋白酶As

39、pAsp的的（C C）PfPf蛋白酶蛋白酶AspAsp的的（C C）羧肽酶A 肽链C端羧肽酶A 肽链C端N基侧N基侧(除Arg、Lys、pro)羧肽酶B 肽链C端(除Arg、Lys、pro)羧肽酶B 肽链C端N基侧，N基侧，Arg、LysArg、Lys羧肽酶C/Y 肽链C端羧肽酶C/Y 肽链C端N基侧N基侧的所有氨基酸的所有氨基酸溴化氢Met溴化氢Met（C）（C）NHNH OHAsnOHAsn- -Gly bondsGly bondsNHNH2 2OHOH AsnAsn- -GlyGly bondsbondspH2.5,40pH2.5,400 0C Asp-Pro bondsC Asp-Pr

40、o bondsStep6: 全部氨基酸序列的重新构建全部氨基酸序列的重新构建CNBr胰蛋白酶胰蛋白酶CNBrCNBrStep7: 二二硫键序列的鉴定硫键序列的鉴定S ep7:硫键序列的鉴定硫键序列的鉴定对角线电泳法对角线电泳法:一种二维的纸电泳技术。:一种二维的纸电泳技术。一向电泳:分离多肽部分水解的小肽，再用一向电泳:分离多肽部分水解的小肽，再用过氧甲过氧甲酸蒸汽酸蒸汽处理处理，氧化肽链上的二硫键氧化肽链上的二硫键，形成一形成一酸蒸汽酸蒸汽处理处理，氧化肽链上的二硫键氧化肽链上的二硫键，形成一形成一对含对含磺基丙氨酸的肽磺基丙氨酸的肽。对含对含磺基丙氨酸的肽磺基丙氨酸的肽。二向电泳:将旋转9

41、0二向电泳:将旋转900 0C,大多数肽沿对角线迁移，含C,大多数肽沿对角线迁移，含磺基丙氨酸的肽磺基丙氨酸的肽比原来的肽小而负电荷增加比原来的肽小而负电荷增加, ,磺基丙氨酸的肽磺基丙氨酸的肽比原来的肽小而负电荷增加比原来的肽小而负电荷增加, , 不落在电泳纸对角线上不落在电泳纸对角线上。不落在电泳纸对角线上不落在电泳纸对角线上。显色:茚三酮显色后，与原多肽链的氨基酸序列比显色:茚三酮显色后，与原多肽链的氨基酸序列比较较，便可确定多肽链中二硫键的置便可确定多肽链中二硫键的置. .较较，便可确定多肽链中二硫键的置便可确定多肽链中二硫键的置. .牛胰核糖核酸酶牛胰核糖核酸酶A包含包含124个氨基

42、酸残基个氨基酸残基和和4个二硫键个二硫键对角线电泳鉴定二硫键的位置对角线电泳鉴定二硫键的位置对角线电泳鉴定二硫键的位置对角线电泳鉴定二硫键的位置对角线电泳鉴定二硫键的位置对角线电泳鉴定二硫键的位置例例1：从下列信息求八肽的序列：从下列信息求八肽的序列1：酸水解得：酸水解得Ala、Arg、Leu、Met、Phe、Thr、2Val2：Sanger试剂处理得试剂处理得DNP-Ala：g试剂处理得试剂处理得3：胰蛋白酶处理得：胰蛋白酶处理得Ala、Arg、Thr和和Leu、Met、phe、2Val，当以，当以Sanger试剂处理这两个肽时，分别得试剂处理这两个肽时，分别得DNP-Ala和和DNP-Va

43、l。4：用用B CN处理时得处理时得Al 、A、M 、Th 、2V l和和L、Ph4：用用BrCN处理时得处理时得Ala、Arg、Met、Thr、2Val和和Leu、Phe,以以Sanger试剂处理时，分别得试剂处理时，分别得DNP-Ala和和DNP-Leu。解：蛋白质用酸水解可得游离的氨基酸。氨基端解：蛋白质用酸水解可得游离的氨基酸。氨基端2 3 4 5 6 7 羧基端羧基端由由2知：知：Ala由由2,3知：知：AlaThrArgVal由由2 3 4知知：AlThAV lM tLPh由由2,3,4知知：Ala ThrArgVal Met LeuPhe由由3,4知：知：Ala ThrArgVa

44、l ValMet LeuPhe因为由因为由3知知，在第二小段中有在第二小段中有2Val，故另一故另一Val只可能在后段只可能在后段。因为由因为由3知知，在第二小段中有在第二小段中有2Val，故另一故另一Val只可能在后段只可能在后段。例例2: 有一种多肽，经分析，它的氨基酸组成是有一种多肽，经分析，它的氨基酸组成是Lys、Gly、Arg、Phe、Ala、Tyr、Ser，此肽不经酶切前与此肽不经酶切前与FDNB反应后没反应后没、 y 、，此肽不经酶切前与此肽不经酶切前与反应后没反应后没有产物生成，此肽经胰凝乳蛋白酶作用后，得到有产物生成，此肽经胰凝乳蛋白酶作用后，得到2个多肽，个多肽，其氨基酸组

45、成分别为其氨基酸组成分别为Ala、Tyr、Ser和和Gly、Phe、Lys、其氨基酸组成分别为其氨基酸组成分别为Ala、Tyr、Ser和和Gly、Phe、Lys、Arg。而这两肽再分别与。而这两肽再分别与FDNB反应得反应得DNP-Ser和和DNP-Lys。此肽与胰蛋白酶反应，同样生成此肽与胰蛋白酶反应，同样生成2个肽，它们的氨基酸组成个肽，它们的氨基酸组成分别是分别是Arg、Gly和和Phe、Tyr、Lys、Ser、Ala。问这个多问这个多分别是分别是g、y和和、 y 、 y 、。问这个多问这个多肽具有怎样的结构？肽具有怎样的结构？解：解：1: 因为与因为与FDNB反应，可测反应，可测N端的

46、氨基酸残基，与端的氨基酸残基，与FDNB反应反应后无产物，即此链为环状。后无产物，即此链为环状。2: 胰凝乳蛋白酶测定胰凝乳蛋白酶测定C端端(Phe、Trp、Tyr)A Al 、S、TA: Ala、Ser、TyrB: Gly、Lys、Arg、Phe3: FDNB测定测定N端端3: FDNB测定测定N端端A: Ser-Ala-TyrB: Lys-Gly、Arg-Pheyyg4: 胰蛋白酶测定胰蛋白酶测定C端端(Lys、Arg)C: Gly-ArgD Ph SAlTLD: Phe-Ser-Ala-Tyr-Lys5: 连接连接Gly-Arg-Phe-Ser-Ala-Tyr-LysGly Arg Ph

47、e Ser Ala Tyr Lys6: 检验题意检验题意中国的成就中国的成就中国的成就中国的成就：19651965年: 根据胰岛素的氨基酸顺序,用人工年: 根据胰岛素的氨基酸顺序,用人工方法成功方法成功合成了合成了具有生物活性的具有生物活性的牛牛方法成功方法成功合成了合成了具有生物活性的具有生物活性的牛牛胰岛素胰岛素，第一次成功地完成了蛋白第一次成功地完成了蛋白胰岛素胰岛素，第一次成功地完成了蛋白第一次成功地完成了蛋白质的全合成。标志着人类在研究生质的全合成。标志着人类在研究生命起源的历程中迈进了一大步命起源的历程中迈进了一大步。命起源的历程中迈进了一大步命起源的历程中迈进了一大步。“蛋白质是

48、生命的存在形式”蛋白质是生命的存在形式”主要完成单位主要完成单位：上海生物化学研究所上海生物化学研究所主要完成单位主要完成单位：上海生物化学研究所上海生物化学研究所北京大学北京大学上海有机化学研究所上海有机化学研究所上海有机化学研究所上海有机化学研究所主要完成者：主要完成者：钮经义钮经义，龚岳亭，龚岳亭，邹承鲁邹承鲁，杜雨苍，杜雨苍，季爱雪(女)季爱雪(女)邢其毅邢其毅，汪猷汪猷，徐杰诚徐杰诚邢其毅邢其毅，汪猷汪猷，徐杰诚徐杰诚我国人工合成的牛胰岛素结晶我国人工合成的牛胰岛素结晶1982年国家自年国家自然科学一等奖然科学一等奖四、肽的自动化合成方式四、肽的自动化合成方式四、肽的自动化合成方式四

49、、肽的自动化合成方式基础：基础：19世纪德国化学家世纪德国化学家Emil发展的发展的羧基的活化、加入或去除封闭基团羧基的活化、加入或去除封闭基团改进改进：年美国的年美国的改进改进：1963年美国的年美国的Bruce Merrifield发明了发明了固相肽合成法固相肽合成法发明了发明了固相肽合成法固相肽合成法短时间内生产长片段的合成肽短时间内生产长片段的合成肽结果结果: 引发了肽化学领域的复兴引发了肽化学领域的复兴1984 Nobel La reate in Chemistr“fhi dlt fth d lf1984 Nobel Laureate in Chemistry “for his de

50、velopment of methodology for chemical synthesis on a solid matrix.” Robert Bruce MerrifieldRobert Bruce MerrifieldRobertRobert BruceBruce MerrifieldMerrifieldBackground Born: 1921Residence: U.S.A.Affiliation: Rockefeller UniversityAffiliation: Rockefeller University, New York, NY 固相肽的化学合成过程固相肽的化学合成过

51、程方向方向CN 与体内蛋白质的合成方向相反与体内蛋白质的合成方向相反方向方向：C N,与体内蛋白质的合成方向相反与体内蛋白质的合成方向相反1 封闭剂封闭剂9 氟甲基羰基氟甲基羰基(蓝色蓝色)。用其封闭氨基酸用其封闭氨基酸1(红色红色)的氨基的氨基1. 封闭剂封闭剂9-氟甲基羰基氟甲基羰基(蓝色蓝色)。用其封闭氨基酸用其封闭氨基酸1(红色红色)的氨基的氨基,形成形成Fmoc-AA1。2. 使使AA1的羧基与活化的不溶性的聚苯乙烯珠的羧基与活化的不溶性的聚苯乙烯珠(商品化商品化)反应，反应，将其附着在树脂的反应性基团上将其附着在树脂的反应性基团上。将其附着在树脂的反应性基团上将其附着在树脂的反应性

52、基团上。3. 有机溶剂从有机溶剂从Fmoc-AA1分子中去除封闭基团。分子中去除封闭基团。4. 二环己二亚胺二环己二亚胺(DCC),用其活化用其活化Fmoc-AA2的羧基。的羧基。5 AA1的氨基攻击的氨基攻击AA2的活化羧基的活化羧基，形成肽键形成肽键。5. AA1的氨基攻击的氨基攻击AA2的活化羧基的活化羧基，形成肽键形成肽键。6. 如此循环往复，合成三肽、四肽如此循环往复，合成三肽、四肽。7. 用氢氟酸用氢氟酸(HF)处理树脂颗粒，释放新合成的多肽。处理树脂颗粒，释放新合成的多肽。固相肽的合成过程固相肽的合成过程-氨基端的封闭氨基端的封闭固相肽的合成过程固相肽的合成过程-封闭氨基端的封闭

53、氨基端的AA1结合到树脂上结合到树脂上AA1AA1AA2固相肽的合成过程固相肽的合成过程-活化羧基端的活化羧基端的AA2与去保护的与去保护的AA1的氨基端形成肽键的氨基端形成肽键固相肽的合成过程固相肽的合成过程-HF将合成好的肽从树脂上切下来将合成好的肽从树脂上切下来固固固固相相肽肽肽肽的的合合合合成成全全全全过过程程程程SummarySummary1 肽键的特征肽键的特征：具有部分双键的性质具有部分双键的性质1. 肽键的特征肽键的特征：具有部分双键的性质具有部分双键的性质羰基氧与亚氨基氢处于相反位置羰基氧与亚氨基氢处于相反位置phi()phi()和和psi()psi()的定义的定义phi()phi()和和psi()psi()的定义的定义2 活性多肽活性多肽：GSHGSH的结构特点的结构特点、功能功能2. 活性多肽活性多肽：GSHGSH的结构特点的结构特点、功能功能3. 蛋白质序列分析蛋白质序列分析：一级结构与功能一级结构与功能蛋白质序列分析蛋白质序列分析一级结构与功能一级结构与功能氨基酸测序策略的七大步骤，氨基酸测序策略的七大步骤，一级序列的推断一级序列的推断一级序列的推断一级序列的推断4. 肽的自动化合成方式肽的自动化合成方式：固相肽合成的基本过程固相肽合成的基本过程肽的自动化合成方式肽的自动化合成方式固相肽合成的基本过程固相肽合成的基本过程