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1、 生 物 工 程 学 报 Chin J Biotech 2009, October 25; 25(10): 1483-1489 Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 2009 Institute of Microbiology, CAS Accepted: September 2, 2009 Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 30771306), Doctoral Foundation of Nantong University (No.
2、09B04). Corresponding author: Chunmei Yu. Tel: +86-513-85015804; Fax: +86-513-85015908; E-mail: 国家自然科学基金项目(No. 30771306), 南通大学博士科研基金项目(No. 09B04)资助。 农业生物技术普通小麦中双脱氢抗坏血酸还原酶(TaDHAR)基因的克 隆与生化特性分析 余春梅1, 杨艳萍2, 3, 刘鑫燕1, 周蓉1, 华梁1, 魏贺1, 丁胜杰1, 王道文2 1 南通大学生命科学学院, 南通 226007 2 中国科学院遗传与发育生物学研究所, 北京 100101 3 中国科学
3、院研究生院, 北京 100049 摘 要: 利用同源克隆技术从六倍体普通小麦中获得了两个不同的双脱氢抗坏血酸还原酶(TaDHAR)基因的 cDNA 克隆。器官表达模式分析表明, 这两个 TaDHAR 基因(暂时命名为 TaDHAR1 和 TaDHAR2)在小麦根、茎、叶、幼穗以及开花后 10 d、20 d 和 30 d 的种子中均有表达, 为组成型表达基因。原生质体表达实验表明, 两个基因的产物均可能定位在细胞质中。在细菌中表达并提纯了两个基因的重组蛋白。体外生化测定表明两个重组蛋白均具有将双脱氢抗坏血酸还原成抗坏血酸的能力, 其最适 pH 为 7.5, 在 37oC 时的活性比 25oC 高
4、, 但 25oC 条件下 pH 6.0 和 7.0 时, 两个 DHAR蛋白的活性显著不同。本研究的结果为进一步揭示 TaDHAR 基因在小麦抗坏血酸代谢中的生理作用奠定了基础。 关键词: 普通小麦, 双脱氢抗坏血酸还原酶, 抗坏血酸, 双脱氢抗坏血酸, 表达模式, 酶活 Molecular and biochemical analysis of two genes encoding dehydroascorbate reductase in common wheat Chunmei Yu1, Yanping Yang2, 3, Xinyan Liu1, Rong Zhou1, Liang H
5、ua1, He Wei1, Shengjie Ding1, and Daowen Wang2 1 School of Life Sciences, Nantong University, Nantong 226007, China 2 Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Science, Beijing 100101, China 3 Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China Abstrac
6、t: Dehydroascorbate reductase (DHAR) plays an important role in the recycling of ascorbic acid. In this work, we isolated the full length cDNA clones of two different DHAR genes (tentatively named as TaDHAR1 and TaDHAR2, respectively) from common wheat. Semi-quantitative PCR experiments showed that
7、TaDHAR1 and TaDHAR2 were transcribed in many vegetative and reproductive organs examined in this work. Transient expression analysis using wheat protoplasts indicated that the protein products of TaDHAR1 and TaDHAR2 may be located in the cytoplasm. The cDNAs of TaDHAR1 and TaDHAR2 were expressed in
8、the bacterial cells, and resultant histidine tagged recombinant proteins could be efficiently purified using nickel chelate affinity chromatography. In vitro enzyme activity assays revealed that the recombinant TaDHAR1 and TaDHAR2 proteins could all convert dehydroascorbate (DHA) to AsA. The two pro
9、teins exhibited higher activity levels at 37oC than at 25oC. Under the two temperature conditions, the optimal pH for TaDHAR1 and TaDHAR2 was both around 7.5. The major difference between TaDHAR1 and 1484 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q Chin J Biotech October 25, 2009 Vol.25 No.10 J TaDHAR2 is the activit
10、y under pH 6.0 and 7.0 at 25oC. The results and resources obtained in this study may be useful for further research into the physiological role of TaDHAR genes in AsA metabolism in crop plants under normal or stressed conditions. Keywords: common wheat, dehydroascorbate reductase, ascorbic acid, deh
11、ydroascorbate, expression pattern, enzyme activity 在真核细胞中, 还原型抗坏血酸(Ascorbic acid, AsA)在参与活性氧清除的过程中被氧化形成单脱氢抗坏血酸(Monodehydroascorbate, MDA), MDA 或通过单脱氢抗坏血酸还原酶(Monodehydroascorbate reductase, MDHAR)再生成 AsA, 或自氧化形成双脱氢抗坏血酸(Dehydroascorbate, DHA)。DHA 可进一步 不 可 逆 地 分 解 形 成2,3- 二 酮 古 洛 糖 酸(Diketogulonic acid
12、), 或通过双脱氢抗坏血酸还原酶(Dehydroascorbate reductase, DHAR)与还原型谷胱甘肽偶联, 再循环形成 AsA。因此, DHAR 对于保持真核细胞中 AsA 的水平具有重要意义1-2。 AsA 作为植物体内重要的还原剂之一, 不仅参与清除植物光合、呼吸作用过程中产生的活性氧, 同时还参与维生素 E 的再生和作为多个酶的辅酶发挥作用2。已有研究表明 DHAR 参与了植物细胞中AsA 的再生, 并通过该过程在植物耐逆反应中发挥重要作用。 Chen 等将从小麦中分离到的 DHAR 基因在玉米和烟草中过量表达, 玉米籽粒和烟草叶片中的 DHAR 表达分别提高了 100
13、和 32 倍, AsA 的含量大幅度增加3。在过表达小麦 DHAR 的转基因烟草株系中, 细胞中 AsA 水平的增加降低了叶片中 H2O2的含量, 对气孔中的信号传递和运动表现出调节作用4。 另外, 在过表达烟草株系中, 叶片的衰老延缓, 叶绿素和叶黄素增加5。在强光下, 过表达 DHAR基因的株系比野生型植株的光抑制要弱6。上述结果不仅证实了 DHAR 参与了植物中 AsA 的再生, 而且表明维持较高水平的 DHAR 活性有利于植物对逆境的抗性。 在模式植物拟南芥中有多个基因编码 DHAR, 分别为 AtDHAR1(At1g19750)、AtDHAR2(At1g75270)和 AtDHAR3
14、(At5g16710)(www.arabidopsis.org), 这些DHAR 在体内发挥的功能不完全相同。不同的AtDHAR 在不同的环境胁迫中有着不同的应答水 平7。细胞质型的 AtDHAR2 在臭氧的胁迫下起主要作用8。利用拟南芥的 DHAR 基因搜索水稻基因组序列资源, 发现在水稻中有两个基因注释为 DHAR功 能 (Os05g0116100和Os06g0232600), 其 中Os05g0116100 (OsDHAR1)编码细胞质型的 DHAR。研究表明, OsDHAR1 在水稻的各个发育时期均表达, 且受高温诱导9。 将 OsDHAR1 在拟南芥中过量表达, 能显著提高转基因拟南
15、芥耐盐能力10, 表明 DHAR在水稻耐逆反应中起重要作用。 小麦是世界最重要的粮食作物之一, 在小麦中开展重要基因的功能研究和挖掘优异等位变异对小麦遗传改良具有重要意义。到目前为止, 除上述将普通小麦的 DHAR 基因转入烟草和玉米中进行研究外3-6, 尚无对 TaDHAR 进行系统分子生物学研究的报道。基于上述讨论, 本项研究的主要目的是认识两个 DHAR 基因在普通小麦不同器官中的表达模式以及其原核表达蛋白产物的生化特性。 1 材料与方法 1.1 材料 供试小麦为栽培品种小偃 54(由中国科学院遗传与发育生物学研究所提供)。利用培养箱(25oC)生长小麦幼苗, 取 2 周幼苗的根和叶片用于总 RNA 的提取。在温室中生长至孕穗期的小麦, 取幼穗(2 cm长)和茎等材料。抽穗后小麦, 取开花当天的小花, 并于授粉后(Days post anthesis, DPA)10 d、20 d 和 30 d分别取籽粒, 置70oC 冰箱备用。 1.2 酶和试剂 PrimerSTAR HS DNA 聚合酶、dNTP、内切酶和 DNA Marker 购自大连宝生物公司。T 载体购自Promega 公司。胶回收试剂盒购自鼎国生物技术有限公司。 质粒提取试剂盒购自碧云天生物技术公司。蛋白 Marker 购自北京全式基因公司
