酶工程绪论

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1、酶 工 程主要参考书n郭勇编著，酶工程。北京：科学出版社 ，2004n罗贵民主编，酶工程。北京：化学工业 出版社，2002n陈石根，周润琦编著，酶学。上海：复 旦大学出版社，2001n郭勇，郑穗平编著，酶学。广州：华南 理工大学出版社，2000第一章 绪论1.1 酶与酶工程概述1.1.1 酶n酶的基本概念与发展史n要准确地说出酶是什么时候、由谁首先发现的，那是件很困难的 事。人们很早就感觉到它的存在，但是真正认识它、利用它还只 是近百年的事。我国从有记载的资料得知，4 000多年前的夏禹时 代酿酒已盛行。酒是酵母发酵的产物，是细胞内酶作用的结果。 公元10世纪左右，我国已能用豆类做酱。豆酱是在

2、霉菌蛋白酶作 用下，豆类蛋白质水解所得的产品。约3 000年前，利用麦曲含有 的淀粉酶将淀粉降解为麦芽糖，制造了饴糖。用曲富治疗消化障 碍症也是我国人民的最早发现。曲富含酶和维生素，至今仍是常 用的健胃药。春秋战国时代，漆已被广为利用，那时所用的漆是 漆树的树脂被漆酶作用的氧化产物。n国外知道酶的存在是与发酵和消化现象联系在一起的。1833年 Payen和Person从麦芽的水抽提物中用酒精沉淀得到了一种对热 不稳定的活性物质，它可促进淀粉水解成可溶性糖。他们把这种 物质称为淀粉酶制剂(diastase)，其意为“分离”，表示可从淀粉中 分离出可溶性糖来。虽然现在已知他们当时得到的是一种很粗的

3、 淀粉酶制剂，但是由于他们采用了最简单的抽提、沉淀等提纯方 法，得到了一种无细胞制剂，并指出了它的催化特性和不稳定性 ，至少开始触及了酶的一些本质问题，所以有人认为Payen和 Person首先发现了酶。1878年德国Kuhne首先把这类物质称为Enzyme。Enzyme来自希腊文 ，原意为“在酵母中”。中文译为酶，说明我国古代对酶的性质、 作用已有相当认识。1896年德国学者Buchner兄弟发现了用石英 砂磨碎的酵母细胞或无细胞滤液能和酵母细胞一样将1分子葡萄 糖转化成2分子乙醇和2分子 CO2 ，他把这种能发酵的蛋白质成分 称为酒化酶(eymase)，表明了酶能以溶解状态、有活性状态从破

4、 碎细胞中分离出来而非细胞本身，从而说明了上述化学变化是由 溶解于细胞液中的酶引起的。此项发现促进了酶的分离和对其理 化性质的探讨，也促进了对有关各种生命过程中酶系统的研究。 一般认为酶学研究始于1896年Buchner的发现。n20世纪初，酶学得到了迅速发展。一方面发现了更多的酶，并注 意到某些酶的作用需要有低分子物质(辅酶)参加；另一方面在物 理、化学技术发展的影响下，Michaelis Menton总结了前人工作 ，根据中间产物学说于1913年提出了酶促反应动力学原理-米氏 学说。这一学说的提出，对酶反应机理的研究是一个重要突破。 1926年，Sumner从刀豆中得到脲酶结晶(这是第一个

5、酶结晶)，并 证实这种结晶催化尿素水解，产生CO2和氨，提出酶本身就是一 种蛋白质。但这个观点直到若干年后获得了胃蛋白酶、胰凝乳蛋 白酶、胰蛋白酶的结晶才被普遍接受，并获得1947年的诺贝尔奖 。现已发现生物体内存在的酶有近8000种，而且每年都有新酶发 现。迄今，数百种酶已纯化达到了均一纯度，大约有200多种酶 得到了结晶。由于蛋白质分析分离技术的飞速发展，特别是在运 用X射线衍射分析等方法后，人们相继弄清n溶菌酶(129个氨基酸残基)、羧肽酶(307个氨基酸残基)、多元淀 粉酶A(460个氨基酸残基)等的结构和作用机理。现在对于细胞基 本代谢过程中的各种酶，很多已有比较清楚的认识，但有关遗

6、传 过程中的酶还有待深入研究。n20世纪50-60年代，发现酶有相当的柔性，因而Koshland提出了“ 诱导契合”理论，以解释酶的催化理论和专一性，同时也搞清了某 些酶的催化活性与生理条件变化有关。1961年Monod及其同事提 出了“变构模型”，用以定量解释有些酶的活性可以通过结合小分 子(效应物)进行调节，从而提供了认识细胞中许多酶调控作用的 基础。n1969年首次报道由氨基酸单体化学合成牛胰核糖核酸酶，虽然这 是一个很大的进展，但其纯度和活性很低。化学合成只是定性证 明了酶和非生物催化剂没有区别。nDNA重组技术用于酶学研究得到高度重视。用定点突变法在指定 位点突变，可以改变酶的催化活

7、性与专一性。这有助于认识酶的 作用机制，并为设计特定需要的酶奠定了基础，如乳酸脱氢酶的 专一性可以通过在活性部位引入3个特定的氨基酸侧链突变成为 苹果酸脱氢酶。n最近发现，除了“经典”酶以外，某些生物分子也有催化活性。 1982年Cech小组发现，四膜虫的rRNA(核糖体核糖核酸)前体能在 完全没有蛋白质的情况下进行自我加工，催化得到成熟的rRNAn产物，称其为自我剪接反应，认为RNA也具有催化活 性，并将这种具有催化活性的RNA称为核酸类酶。这 对酶的传统概念是个严重挑战，提出了酶并不一定是 蛋白质的问题。n1983年,阿尔特曼（Altman)等人发现核糖核酸酶 P(RNase P)的RNA

8、部分M1 RNA具有核糖核酸酶P的催 化活性， 可在高浓度镁离子的存在条件下，单独催化 tRNA前体从端切除某些核苷酸片段成为成熟的tRNA ，而该酶的蛋白质部分C5蛋白却没有酶活性。RNA具有催化活性这一发现，改变有关酶的概念，被 认为是最近年来生物科学领域最令人鼓舞的发现 之一。 Cech和Altman因此共同获得1989年度的诺贝尔 化学奖。nRNA型生物催化剂的发现在现代生物学中的意义1.表明RNA除了作为遗传信息的载体外，还可能具有其他生物学 功能；2.表明除了蛋白质性质的酶外，还可能存在其他类型的生物催化剂 ；3.为分子生物学研究，特别是为RNA的研究提供了又一种新工具；4.为地球

9、上生命的起源提供了新的重要线索。n近年来，又出现了DNA具有催化活性的报道。n酶是特殊的催化剂n具有高效、专一性强和作用条件温和等特点n按照其化学组成，可分为蛋白类酶（P酶）和核酸 类酶(R酶)两大类。蛋白类酶主要由蛋白质组成，核 酸类酶主要由核糖核酸（RNA)组成。n酶是生物催化剂n所有酶都由生物体产生n已知的酶都是由生物体合成的；n几乎所有的生物都能合成酶。n酶和生命活动密切相关n酶参与了生物体内所有的生命活动和生命过程n酶在生物体内发挥四种类型的作用：n执行具体的生理机能；n清除有害物质，起着保卫作用；n协同激素等生理活性物质在体内发挥信号转换、传递和放 大作用，调节生理过程和生命活动；

10、n催化代谢反应，建立各种各样代谢途径和代谢体系。n酶的组成和分布是生物进化与组织功能分化的基础n不同生物有各自特征的酶系和酶谱；n同类生物，酶的组成和分布也有明显的种属差异；n同种生物，各种组织内酶的分布也有所不同；n同一细胞，甚至同一细胞器内，酶的组成和分布也不是均一的 。n酶能在多种水平上进行调节以适应生命活动的需要n合成水平上的调节；n结构、活性水平上的调节。1.1.2 酶工程概述n生物工程学(biotechnology)也叫生物技术或生物工艺学，是20世 纪70年代初在分子生物学和细胞生物学基础上发展起来的一个新 兴技术领域。酶工程(enzyme engineering)是生物工程的主

11、要内 容之一，是随着酶学研究迅速发展，特别是酶的应用推广使酶学 和工程学相互渗透结合、发展而成的一门新的技术科学，是酶学 、微生物学的基本原理与化学工程有机结合而产生的边缘科学技 术。它是从应用的目的出发研究酶，是在一定生物反应装置中利 用酶的催化性质，将相应原料转化成有用物质的技术，是生物工 程的重要组成部分。n酶是生物体内进行自我复制、新陈代谢所不可缺少的生物催化剂 。由于酶能在常温、常压、中性pH等温和条件下高度专一有效地 催化底物发生反应，所以酶的开发和利用是当代新技术革命中的 一个重要课题。酶工程主要指酶的生产与应用的技术过程，其主 要内容包括：微生物发酵产酶；动植物细胞培养产酶；酶

12、的提取 与分离纯化；酶分子修饰；酶、细胞和原生质体固定化；酶的非 水相催化；酶反应器和酶的应用。n一般认为，酶工程的发展历史应从第二次世界大战后算起。从20 世纪50年代开始，由微生物发酵液中分离出一些酶，制成酶制剂 。60年代后，由于固定化酶、固定化细胞崛起，使酶制剂的应用 技术面貌一新。70年代后期以来，由于微生物学、遗传工程及n细胞工程的发展为酶工程进一步向纵深发展带来勃勃生机，从酶 的制备方法、酶的应用范围到后处理工艺都受到巨大冲击。尽管 目前业已发现和鉴定的酶约有8000多种，但大规模生产和应用的 商品酶只有数十种。自然酶在工业应用上受到限制的原因主要有 ：大多数酶脱离其生理环境后极

13、不稳定，而酶在生产和应用过 程中的条件往往与其生理环境相去甚远；酶的分离纯化工艺复 杂；酶制剂成本较高。因此，根据研究和解决上述问题的手段 不同把酶工程分为化学酶工程和生物酶工程。前者指自然酶、化 学修饰酶、固定化酶及化学人工酶的研究和应用，后者则是酶学 和以基因重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物，主 要包括3个方面：用基因工程技术大量生产酶(克隆酶)；修饰 酶基因产生遗传修饰酶(突变酶)；设计新的酶基因合成自然界 不曾有的新酶。n1971年，第一次国际酶工程会议在Hennileer召开，当时酶制剂已 广泛用于工业和临床。如千钿等人将固定化氨基酰化酶拆分氨基 酸技术用于工业化生产L-

14、氨基酸，开创了固定化酶应用的局面， 千钿也因而成为1983年酶工程会议获奖人。此后，固定化天冬氨 酸酶合成L-天冬氨酸、固定化葡萄糖异构酶(生产高果糖浆)等的 工业化生产取得成功。固定化酶较自由酶具有很多优点：稳定 性高；酶可反复使用；产物纯度高，副产物少，从而有利提 纯；生产可连续化、自动化；设备小型化，节约能源等。因 此固定化酶研究仍是酶工程研究的中心，其应用范围越来越广。 除应用于传统的食品工业(乳糖的分解、乳酪制造、牛奶消毒、酒 精生产等)外，在其他领域如有机合成反应、分析化学、医疗、废 液处理、亲和层析等也获得广泛应用。n在固定化酶的基础上又逐渐发展固定化细胞的技术。近年来，后 来居

15、上的固定化细胞技术发展更为迅速，在实际应用方面已大大 超过固定化酶。在工业应用方面，利用固定化酵母细胞发酵生产 酒精、啤酒的研究较引人注目。日本Toshio Onaka等用海藻酸钙 凝胶包埋酵母细胞，可在一天内获得质量优良的啤酒。法国 Corriell等将酵母细胞固定在聚氯乙烯碎片和多孔砖等载体上进行 啤酒发酵中型试验，可连续运转8个月。中国上海工业微生物研 究所等单位也从20世纪70年代后期进行过类似的研究工作，用固 定化酵母发酵啤酒的规模不断扩大，已正式投入大规模生产。n以往对微生物细胞固定化多集中在细菌和酵母。然而，很多具有 工业生产价值的代谢产物(如酶、抗生素、有机酸和甾体化合物等 )

16、都是由丝状真菌生产的。目前用于固定丝状真菌的方法主要是吸 附法和包埋法。但包埋法由于限制了足够的氧气供给细胞，使固 定化丝状真菌生产代谢产物的效率非常低。瑞典Mosbach等提出 一种利用高分子聚合物包埋各种细胞的通用的固定化方法，能固 定细菌、酵母、动植物细胞及人工组建的细胞，生产各种代谢产 物。1984年，他们曾用琼脂糖胶分别包埋杂交瘤细胞LSP21和淋 巴细胞MLA生产单克隆抗体和白细胞介素。1980年，Wagner等人 报道，将大肠杆菌ACTT11105的青霉素酰化酶基因克隆到质粒上 ，获得产酶活力更高的大肠杆菌5K(PHMl2)杂交株，并将此大肠 杆菌杂交株固定，用于生产青霉素酰化酶。这是基因工程与酶工 程相结合的第一例。近年来，有关藻类等各种植物细胞、原生动 物等各种动物细胞固定化研究十分活跃。1980n年， Lim和Sun报道，用海藻酸钙包埋胰岛细胞可用于大白鼠糖 尿病的治疗研究。n酶制剂的应用并不一定都需要固定化，而且需要固定化的天然酶 也仍有必要提高其活力，改善其某些性质，以便更好地发挥酶的 催化功