慢性乙肝分子指标

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1、慢性乙型肝炎诊断与治疗中的 分子指标杨志军乙型肝炎病毒感染的现状l全球约有3.5亿人感染乙型肝炎病毒，中 国有1.2亿人感染，其中每年约有1-2%会 出现肝硬化或肝癌而死亡HBV病毒颗粒感染肝细胞及DNA复制过程慢性乙肝的诊断lHBsAg持续阳性6个月以上lHBV-DNA高于105拷贝/毫升lALT持续升高或反复升高慢性乙肝的分类lHBeAg阳性乙肝：HBsAg、HBeAg阳性 ； HBV-DNA高于105拷贝/毫升；ALT持 续升高或反复升高lHBeAg阴性乙肝：HBsAg、anti-HBe阳 性； HBV-DNA高于104拷贝/毫升；ALT 持续升高或反复升高诊断慢性乙肝的指标l生化指标：

2、ALTl免疫学指标：HBsAg（携带指标）、 HBeAg（活动指标）l病毒学指标：HBV-DNAlHBeAg阴性乙肝缺乏病毒活动的免疫学 指标，前S1可以弥补这一缺憾，提供 HBeAg阴性乙肝患者病毒活动的免疫学 指标HBV-DNA检测的基本要求l虽然国内HBV-DNA检测都用实时荧光PCR法 ，但不同厂家的产品定量标准的赋值有差异， 从而导致定量结果的差异，而准确的定量结果 直接影响到对病人的诊断以及治疗方案的选择lHBV DNA定量试剂的溯源和标准化将是一种 基本趋势慢性乙肝治疗的长期目标l防止发展成为肝硬化或肝细胞癌l在临床上，往往以比较现实的短期目标 来代替长期目标慢性乙肝治疗的短期目

3、标l病毒抑制：表现为HBeAg血清转换和 HBV-DNA阴转l肝损伤程度降低：表现为转氨酶恢复正 常l完全清除病毒：表现为HBsAg消失， HBsAb出现，血清和肝细胞中检测不到 HBV-DNAl从目前水平来看，不可能完全清除病毒治疗慢性乙肝的药物l免疫调节剂：干扰素、PEG干扰素、胸 腺肽l核苷类似物：拉米夫定、阿德福韦、替 比夫定、恩替卡韦、泰诺福韦等拉米夫定治疗与转氨酶浓度l拉米夫定治疗一年后的HBeAg阴转率和 HBV-DNA阴转率：ALT浓度低于2倍正常值高限：5%ALT浓度介于2-5倍正常值高限：26%ALT浓度高于5倍正常值高限：64%HBV-DNA定量检测的临床应用l慢性乙肝诊

4、断l治疗监测和疗效评价l跟踪随访l预后判断HBV-DNA定量慢性乙肝的诊断lHBsAg阳性六个月以上lALT持续升高或反复升高lHBV-DNA大于105拷贝/毫升（HBeAg阳 性）或104拷贝/毫升（HBeAg阴性）HBV-DNA定量抗病毒治疗的条件lALT高于2ULN（正常值上限）lHBV-DNA大于105拷贝/毫升（HBeAg阳性） 或104拷贝/毫升（HBeAg阴性）lATL持续正常的患者可暂不进行治疗，每隔3- 6个月随访肝功能、血清病毒学标志物和进行 肝细胞肝癌监测 lALT水平在1-2倍ULN之间，需根据具体情况( 如肝活检结果等)， 在告知患者治疗的利与弊 、了解患者配合程度的

5、前提下，决定是否实施 治疗。无论治疗与否均应密切随访，为治疗提 供更为科学的根据HBV-DNA定量慢性乙肝的治疗监测l治疗前检测患者的基线水平（ALT、 HBV-DNA）l治疗开始后前三个月每月一次、以后每 三个月一次检测ALT、HBV-DNA，对 于HBeAg阳性患者，还需检测HBeAgl如果治疗期间HBV-DNA水平降低两个 数量级，可以认为治疗有效HBV-DNA定量疗效评价（1）l生化学应答：完全应答：2次监测ALT均 复常(间隔1个月)；无应答：ALT未恢复 正常。值得注意的是评价生化学应答时 应排除其他药物或疾病对ALT升高或下 降的影响 HBV-DNA定量疗效评价（2）l病毒学应答

6、：完全应答按所采用的HBV DNA检测方法说明书上提供的实验敏感 性和检测范围确定，临床上一般认为采 用国际公认的检测方法或敏感性相当的 检测方法检测HBV DNA定量105拷贝/ 毫升或斑点杂交法阴性为完全应答；部 分应答为未达完全应答标准但HBV DNA 载量下降大于2个对数级；无应答为未达 上述标准HBV-DNA定量疗效评价（3）l血清免疫学应答：完全应答为HBeAg/抗 HBe血清转换；部分应答为HBeAg阴转 但未出现抗HBe；无应答为未达上述标 准。HBV-DNA定量综合疗效评价（1）l完全应答为疗程结束时，生化学、病毒 学和血清免疫学所有指标均达到完全应 答HBV-DNA定量综合

7、疗效评价（2）l部分应答为疗程结束时，生化学、病毒 学和血清免疫学指标介于完全应答和无 应答之间HBV-DNA定量综合疗效评价（3）l无应答为疗程结束时，生化学、病毒学 和血清免疫学指标均为无应答 lHBeAg阴性伴HBV DNA活跃复制的慢 性乙型肝炎患者不进行血清免疫学应答 评价，但应进行生化学和病毒学指标的 疗效评价HBV-DNA定量何时可以停药（1）l治疗前HBeAg阳性的患者，治疗1年时 综合疗效达到完全应答者建议至少继续 用药6个月，期间每3个月1次复查ALT、 HBVDNA、HBeAg/抗HBe，仍持续完全 应答者可停药观察 HBV-DNA定量何时可以停药（2）l治疗前HBeAg

8、阳性的患者，治疗1年时 综合疗效达到部分应答者建议继续用药 直至达到完全应答后，再继续用药至少6 个月，期间每3个月1次复查ALT、HBV DNA、HBeAg/抗HBe，仍持续完全应答 者可停药观察HBV-DNA定量何时可以停药（3）l治疗前HBeAg阳性患者治疗1年时综合 疗效仍无应答可停药观察，或改用其他 有效的抗病毒药治疗。对于有肝脏组织 学检查等其它临床指征显示病情进展合 并肝功能失代偿或肝硬化的病人，不宜 轻易停药，并应加强对症保肝治疗HBV-DNA定量何时可以停药（4）lHBeAg阴性伴HBV DNA活跃复制的慢 性乙型肝炎患者，综合疗效完全应答者 疗程至少2年；对于完成1年治疗仍

9、无应 答者可改用或加用其他有效 治疗方案 HBV-DNA定量治疗后的随访l无论有否治疗应答，都应对患者定期随 访。建议停药后的前3个月每月1次、以 后每36个月1次检测ALT、AST、HBV 血清标志物和HBV DNA，以及临床表现 和不良反应。随访至少6-12个月。如病 情有变化，可随时随访。HBV拉米夫定耐药l虽然拉米夫定治疗慢性乙肝疗效显著， 但长期使用拉米夫定会出现耐药现象l使用一年、二年、三年、四年的耐药比 率为：15-32%、38%、56%、67%l一旦出现拉米夫定耐药突变（YMDD变 异），大多数患者会在2-4个月之内出现 HBV-DNA和ALT反弹YMDD变异检测l采用实时荧光

10、定量PCR方法，不仅能够 检测出现的突变类型（YVDD或YIDD） ，而且能够确定突变株所占比例，对及 时调整治疗方案具有非常重要的意义l能够准确稳定的检测到1%的突变株，能 够更早发现耐药突变，尽早调整治疗方 案HBV 拉米夫定耐药突变检测试剂原理Primer FPrimer FPrimer FProbeProbeProbePrimer HBVPrimer YIDDPrimer YVDDHBV检测I突变检测V突变检测YMDD的定量检测l采用选择性引物，基于TaqMan实时PCR 技术，在三个平行反应中分别扩增总 HBV(C管）、YIDD（I管）、YVDD（ V管），根据管间Ct值差异计算突变

11、毒 株在病毒群体中的比例YMDD的定量检测YMDD的定量检测YMDD的定量检测YMDD的定量检测YMDD的定量检测与其它方法的比较lComparison of results obtained by sequencing, pyrosequencing and real-time PCRlTypesSequencingpyrosequencing real-time PCRlrtM20425 (36%)24 (35%)23 (33%)lrtM204I26 (38%)24 (35%)21 (30%)lrtM204V18 (26%)19 (27%)20 (29%)lrtM204I + rtM204

12、V 02 (3%)5 (8%)YMDD变异定性判断的临界值l定性判断：Ct 3.5，此时病毒群体中 突变株比例大于10%l与测序法比较，15例标本结果完全符合YMDD变异定性判断的临界值什么时候开始检测YMDD变异l拉米夫定治疗过程中YMDD变异情况l治疗时间 HBV DNA大于104copies/ml例数 YMDD变异例数*l 6个月61（17%）l612个月2614（54%）l1224个月3826（68%）l2436个月3838（100%）l* 各组之间两两比较均有显著差异（P0.05）。YMDD变异株的动态变化YMDD变异株的动态变化YMDD检测试剂应用方法l对接受拉米夫定治疗的慢性乙肝

13、患者进行耐药 监测l治疗前检测一次（约有10-20%的人在治疗前 就有YMDD变异）l治疗开始后第七个月开始，每三个月检测一次l拉米夫定耐药、替比夫定耐药（YIDD）l恩替卡韦治疗YMDD变异患者存在耐药高风 险慢性乙肝的基因分型l乙肝病毒分八个基因型：根据基因组序 列的差异可以分为AH八种亚型，我国 以B型（41%）和C型（53%）为主l不同基因型病毒感染的病程和后果不同 ：C型对肝的损伤比B型严重，基因型C 比基因型B更容易发展成为肝硬化l不同的基因型对药物的应答也不一样： 基因型B比基因型C对干扰素治疗的应答 率高HBV基因分型PCR检测试剂l运用多重、多色实时PCR技术，分别对乙肝 病

14、毒（HBV）各种基因型序列进行分析l根据国内HBV基因型的特点，设计能检测 HBV AD四种基因型特异性引物及探针l研制开发具有自主知识产权的乙肝病毒（ HBV）基因分型多重、多色实时PCR检测试剂盒 HBV基因分型 结果判断方法B管（Ct36）B管（Ct36） C管（Ct36）B型、C型HBV复 合感染2C型HBVC管（Ct36）B型HBV非B非C型，或 HBV（-）HBV基因分型 分型识别率分型识别率（12+22）/3597样本数百分比B型1234%C型2263%未检出13%总计35100%HBV基因分型 分型灵敏度（1）HBV B型血清样本灵敏度约在2103IU/mlHBV基因分型 分型

15、灵敏度（2）HBV C型血清样本灵敏度约在1103IU/ml共价闭合环状DNA (cccDNA)检测lHBV cccDNA是乙肝病毒前基因组RNA 复制的原始模板l只有彻底清除了cccDNA，乙肝的治疗才 能算真正有效lHBV cccDNA可作为评价抗病毒治疗效 果新的有效指标HBV cccDNA PCR检测试剂l运用实时PCR技术，根据乙肝病毒共价 闭合环状DNA（cccDNA）和双链松弛 环状DNA（rcDNA）分子结构上的差异 ，即rcDNA负链上的缺口和正链的不完 整性，设计一对特异性cccDNA的引物， 分别杂交于1500和2100邻近区域(以 EcoR I切点为物理起始原点)，同时

16、设计 一条杂交于负链3端近缺口处检测探针 ，研制开发具有自主知识产权的HBV cccDNA实时PCR检测试剂盒。HBV cccDNA检测试剂原理rcDNA不能被扩增无荧光信号cccDNA能被扩增检测到荧光信号P118201590+3200（1）EcoR IP2EcoR I5+P23200(1)53159031820P1阿德福韦治疗乙型肝炎l阿德福韦为5-单磷酸脱氧阿糖腺苷类似物，可明 显抑制HBV DNA复制l HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者，1、2、3年时的 耐药发生率分别为0%、1.6%、3.1%lHBeAg阴性者1、2、3年的耐药发生率分别为0% 、3.0%、5.9%11% 阿德福韦耐药突变位点rtN236T、rtA181V/T恩替卡韦治疗乙型肝炎l拉米夫定耐药的病毒株对恩替卡韦敏感性降低8 至30倍；l发生YMDD变异患者治疗1 年时对恩替卡韦耐药 发生率为5.8%，并出现相关的位点变异。恩替卡韦耐药突变位点l如果乙肝病毒多聚酶存在rtL180M和/或rt M204