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1、免疫学检验吴倩 讲师 卫生检验系 公共卫生学院 南京医科大学 025-86862938 13921433351 第一节 酶免疫技术的原理 第二节 酶免疫技术的分类 第三节 酶联免疫吸附试验 第四节 固相酶免疫测定的技术要点 第五节 酶免疫组织化学技术 第六节 其他酶免疫技术 第七节 酶免疫测定的应用第八章 酶免疫技术第一节 酶免疫技术的原理o主要试剂:酶标记的抗体或抗原o酶标物特点：免疫学活性酶对底物的催化活性抗原抗体反应的特异性+酶促催化反应的高敏感性原理及特点特点： 灵敏度高、特异性强、 准确性好 酶标记试剂能够较长时 间保持稳定 操作简便、对环境没有 污染。 易与其它技术偶联 衍生出适用
2、范围更广的 新方法。原理： 酶标抗体（抗原）与抗原 （抗体）的特异性反应 酶对底物的显色反应 对抗原或抗体进行定位、 定性或定量的测定分析 原理及特点第二节 酶免疫技术分类酶 免 疫 技 术酶免疫组化酶免疫测定均 相异相固相酶免疫测定液相酶免疫测定组织切片中的抗原抗体反应 液体标本中抗原或 抗体的定性和定量(ELISA)用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定 酶标记物与相应的抗原或抗体结合后， 标记酶的活性会发生改变，不用分离结合 和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性 的改变，而确定抗原或抗体的含量。 Ag+Ab-E Ag-Ab-E+?原理一、均相酶免疫测定最具代表性的两种技术酶放大免疫测定技
3、术EMIT enzyme-mutiplied immunoassay technique 克隆酶供体免疫分析 CEDIAcloned enzyme donor immunoassay 均相酶免疫测定EMIT示意图CEDIA示意图分类：液相酶免疫测定固相酶免疫测定以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试 验（ELISA） 是目前最为常用的固相酶免疫测定与均相不同 之处 需分离游离与结合的酶标记物二、异相酶免疫测定第三节 酶联免疫吸附试验三个部分：免疫反应酶与底物反应检测方法的建立ELISA酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA ）高
4、纯度的抗原、高亲和力的抗体高活性、高纯度的标记用酶有效的交联方法制备高质量的酶标记物选用适宜的酶/底物系统分离结合与游离标记物的方法建立操作步骤以及研究自动化测定技术底物显色定性或定量的分析原理包被反应加入待测抗体或 抗原和酶标抗原 或抗体洗涤使结合在固相上 的抗原抗体复合物 与未结合的分离1234一、基本原理固相的抗原或抗体 酶标记物 酶反应的底物 三个必要试剂 二、方法类型及反应原理双抗体夹心法（double antibody sandwich-ELISA）方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体 ，加底物显色应用：二价或二价以上的较大分子抗原测定(乙型肝炎表 面抗原HBsAg),
5、不能用于半抗原等小分子的测定。ELISA检测抗原的方法双抗体夹心法测抗原+-EEEEEEEEEELISA检测抗体的方法捕获法 原理： 抗人IgM链抗体包被捕获待测标本中IgM类抗体加入特异性抗原和酶标记特 异性抗原的抗体 底物显色 应用： 病原体急性感染诊断中的 IgM型抗体甲型肝炎HAV-IgM抗体乙型肝炎病毒核心HBc- IgM抗体捕获法原理+-EE EEE1、固相化抗人IgM1、固相化抗人IgM2、加待测物 特异性IgM与 非特异性IgM 和抗人IgM结合3、加特异性 抗原，与特异 性抗体结合4、加酶标抗体 与特异性抗原结 合，加底物显色2、加待测物 只有非特异性IgM 和抗人IgM结合
6、3、加特异性抗 原，不能与非 特异性IgM结合4、加酶标抗体 无抗原结合， 加底物不显色第四节 固相酶免疫测定的技术要 点试剂的准备 反应条件的选择 操作的标准化一、试剂的准备o（一）固相载体 聚苯乙烯特点：吸附蛋白能力强，保留其免疫活性形状：小试管、小珠、微量ELISA板使用前检测其性能o（二）抗原和抗体高纯度的Ag高效价的Ab 一、试剂的准备o（三）酶和底物的选择 标记酶的要求：活性高性质稳定专一性强酶催化底物的显色信号易于判断和测量方法敏感，重复性好，简单易行酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉辣根过氧化物酶（HRP） 糖蛋白（主酶） 亚铁血红素（辅基） 主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中
7、心RZ值：403nm （辅基） 与275nm（主酶） OD值之比 RZ值与酶活性无关 ，酶活性单位比RZ 值更为重要 ELISA中应用最为广 泛的标记用酶 常用酶HRP的底物 DH2+H2O2 D+2H2O HRP供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多种 H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高（ 小分子醇和尿素的过氧化物） 常用底物HRP的常见底物 邻苯二胺 OPD四甲基联苯胺 TMB5-氨基水杨酸5-ASA 2,2-氨基-二(3-乙基-苯并噻 唑啉磺酸-6)铵盐 ABTS常用底物OPD反应后显橙黄 色，加酸终止反 应后呈棕黄色， 测定波长492nm。 不稳定，致癌性 。TMB反应后显蓝
8、色 ，加酸终止反应后 变为黄色,测定波长 450nm ，稳定，无 致癌性，ELISA中应 用最广泛的底物。 HRP的常见底物 碱性磷酸酶（ALP）菌源性ALP 肠粘膜ALP(小牛) 半乳糖苷酶（-Gal）常用酶大肠埃希氏菌 ALP的 底物 -Gal 的底物 对-硝基苯磷酸酯（ pNPP ）4-甲基伞酮基-D 半-乳糖苷（ 4MUG ）经ALP作用后的产物为黄色对 硝基酚，最大吸收峰波长为 405 nm。 酶作用后，生成高强度 荧光物 ，用荧光计 测 量。常用底物二、酶标记抗体或抗原的方法酶免疫技术的核心组成部分 酶结合物（ conjugate） 酶标记物 通过化学反应或免 疫学反应，让酶与 抗
9、体或抗原形成的结合物 抗原要求纯度高，抗原性完整 抗体需要特异性好、效价高、亲 合力强以及比活性较高，能批量生 产，易纯化。 制备方法要求制备方法过碘酸钠法（直接法）常用于HRP标记抗体或抗原 戊二醛交联法戊二醛交联法戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别 与HRP和蛋白质分子中的氨基结合。该法 有一步法和二步法。二步法标记效率比一 步法高，酶标记物质量较均一。 纯化标记完成后应除去反应液中的游离酶 、游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗 体或抗原聚合物，避免游离酶增加非 特异显色，以及游离抗体或抗原起竞 争作用而降低特异性染色强度 常用的纯化方法： 葡聚糖凝胶（Sephadex）G-200/G-15
10、0过 柱层析纯化 50%饱和硫酸铵沉淀提纯 亲和层析效果更好（SPA-IgG;ConA-HRP）二、酶标记物的纯化和鉴定鉴定质量鉴定（ELISA法直接测定）HRP标记IgG的酶标记率（戊二醛法） 酶结合量（mg/ml） IgG量（mg/ml） HRP/ IgG摩尔比 酶的标记率四、最适工作浓度的选择(棋盘法)10 + 1:10001.1710 + 1:10000.1510 - 1:10000.091.0 + 1:100021.0 + 1:10000.261.0 - 1:10000.120.1 + 1:10000.420.1 + 1:10000.140.1 - 1:10000.1110 + 1:
11、50000.4610 + 1:50000.0310 - 1:500001.0 + 1:50000.91.0 + 1:50000.121.0 - 1:50000.010.1 + 1:50000.120.1 + 1:50000.040.1 - 1:50000.0210 + 1:100000.1210 + 1:10000010-1:1000001.0 + 1:100000.221.0 + 1:100000.011.0 - 1:1000000.1 + 1:100000.030.1 + 1:1000000.1 - 1:100000五、测定方法的标准化o包被o加样o洗涤o孵育o结果判定o理想coating
12、：吸附尽可能多的Ag或Ab；吸附牢 固；非特异性吸附较少o包被机制1、物理性吸附（被动的）2、共价交联（戊二醛，标准化）o影响包被的因素1、包被物质的性质及其浓度2、包被缓冲溶液的pH及离子强度3、包被温度和时间o包被物质的性质及其浓度聚苯乙烯吸附抗原效果好聚乙烯吸附抗体效果好浓度过高引起前带现象浓度过低引起非特异性吸附(BSA封闭)o包被缓冲溶液的pH及离子强度相对低的离子强度有利于蛋白质分子吸附固相表面o包被温度和时间置4冰箱过夜，或37 孵育2ho加样加样量准确加样位置不产生气泡o洗涤目的1、洗去未结合的物质2、洗去非特异性吸附要求1、每孔充满液体2、去净洗涤液（Tween20）3、冲洗
13、次数和浸泡时间足够4、具有传染性样品必须采用全自动冲洗o孵育定义：要使抗原抗体反应和酶催化反应顺利进行，需要合适的 pH和适当离子强度的基质液，保持一定的温度，并作用一定时间 ，整个过程称为孵育或温育。方法：干式湿氏推荐温度：37增强作用:聚乙二醇反应时间:以阳性标本的吸光度值达到1.0时为反应终点o结果判定1、吸光度法（A）2、比例法(A/A0)3、滴度法（倍比稀释样品）4、吸光度直接表示阳性的程度（均一化）5、标准曲线法第五节 酶免疫组织化学技术酶免疫组织化学技术(enzyme immunohistochemistry technique)o定义在一定条件下，应用酶标抗体或抗原与细胞或普通
14、组 织切片中抗原或抗体反应，酶与底物作用形成有色沉 淀物或产物电子密度发生改变，在光镜和电镜下，就 可识别出标本中抗原或抗体的分布和性质；经图像分 析也可达到定量的目的。o种类1、标记抗体免疫组织化学技术2、非标记抗体酶免疫组织化学技术3、酶标记免疫电镜技术o1、标记抗体免疫组织化学技术第六节 其他酶免疫技术o免疫印记法（immunoblotting test）其他酶免疫技术o生物素-亲和素（BSA）-酶联免疫吸附试 验生物素（biotin）-亲和素（avidin）亲和素与生物素之间的亲和力极强，比抗原与抗体的 亲和力至少高1万倍，且具有高度特异性和稳定性。其他酶免疫技术第七节 酶免疫测定的应
15、用oELISA在预防医学、临床医学的应用病原体及其抗体的检测（乙肝两对半）蛋白质的检测非肽类激素的检测药物的检测尿中毒品的检测酶免疫测定的应用oELISA在食品检测中的应用食品中微生物的检测食品毒素的检测（黄曲霉毒素）食品中残留农药的检测（除草剂、杀菌剂和杀 虫剂）食品中残留抗生素的检测（氯霉素、磺胺类、 呋喃类、喹诺酮类）酶免疫测定的应用oELISA在转基因食品检测中的应用（PCR- ELISA方法）DNA检测蛋白质检测酶免疫测定的应用1酶免疫技术的要点？ 2酶联免疫吸附试验的原理（ELISA）？ 3竞争法在酶联免疫检测应用中的原理和应用？ 4常用的底物有哪几类？特点？ 5常用的酶有哪几类？
16、特点？ 6何谓包被与封闭？其作用？ 7对酶免疫技术的应用评价如何？思考题o酶免疫技术是标记免疫技术的一种，它是以酶标记的抗原或抗 体作为主要试剂的免疫检测方法，在抗原与抗体的特异性反应 完成后，通过酶对底物的作用进一步提高敏感性。酶免疫技术 可分为酶免疫组织化学技术和酶免疫测定两大类,后者根据抗 原抗体反应后是否需要分离结合与游离的酶标记物而分为均相 和非均相两种类型。o均相酶免疫测定主要用于小分子物质和半抗原的测定，非均相 酶免疫测定根据是否使用固相支持物，又可分为液相和固相酶 免疫测定两种类型。最常用的是以聚苯乙烯等材料作为固相载 体的酶联免疫吸附试验（ELISA）,其原理可以有夹心法、竞争 法、间接法和捕获法等。小 结
