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1、泰山灰树花产海藻糖母种泰山灰树花产海藻糖母种 培养基的筛选培养基的筛选【摘要】目的筛选适合灰树花产海藻糖的母种培养基配方。方法通过四种不同固体培养基培养灰树花菌种，比较其生长状况，并进行液体摇瓶培养，采用蒽酮硫酸法测定海藻糖产量。结果在马铃薯板栗壳培养基上生长的灰树花长势强，颜色亮白，菌丝浓密，生长速度快（长速：7.5 mm/d，满管时间：10.8 d） ；此菌种在液体发酵中生物量和海藻糖产量也很高，分别为 17.6 g/L 和 3.4 g/L。结论马铃薯板栗壳培养基是一种优良的灰树花母种培养基，有利于提高液体发酵中海藻糖的产量。 【关键词】 灰树花；海藻糖；马铃薯板栗壳培养基；发酵培养基；蒽
2、酮硫酸法 Screening of mother medium for trehalose production by Grifola frondosaLI Heng, SUN Mingli, LI Yanling(Dept. of Biological Sciences,Taishan Medical College, Taian 271016, China)Abstract:Objective: To select the mother medium composition of Grifola frondosa for the production of trehalose. Metho
3、ds: Grifola frondosa strains were cultured to compare their growth by four different solid media, and then cultured by liquid culture flask. Trehalose was determinated by anthronesulphuric acid method. Results: Grifold frondosa growing on the potato chestnut shell medium was strong, thick, white and
4、 grew quickily (growth ratio 7.5per day, 10.8days to fill out the test tube)，and the yield of mycelium dry weight was 17.6 g/L and trehalose was 3.41 g/L.Conclusion: Potato chestnut shell medium is a good mother medium of Grifola frondosa, conducive to improving the yield of trehalose from liquid fe
5、rmentation medium.Key words:Grifola frondosa; trehalose; potato chestnut shell medium; fermentation medium; anthronesulphuric acid method灰树花(Grifola frondosa)是一种食、药兼用蕈菌，属担子菌亚门层菌纲非褶菌目多孔菌科树花菌属，具有防癌、抗癌、抗疲劳及提高人体免疫功能的作用，对肝硬化、糖尿病、水肿、脚气病、小便不利等症有显著疗效13 。灰树花中含有多糖、双糖、多种微量元素、维生素等有效活性成分，其中海藻糖含量远远高于其他食用菌4 ，但目前从灰
6、树花中提取海藻糖的研究甚少。海藻糖是由两个葡萄糖分子以 a,a1,1糖苷键构成非还原性糖，对生物体具有神奇的保护作用。研究证明，海藻糖是一种对环境变化形成的应激状态具有高抗性的物质，也是生物体内的一种典型的应激代谢物。尤其是外源性的海藻糖同样具有对生物体和生物大分子的良好的非特异性的保护作用5 ，自然界中如蔗糖、葡萄糖等其它糖类，均不具备这一功能。它广泛存在于藻类、细菌、真菌、酵母、昆虫及无脊椎动物中，能够在高温、高寒、干燥失水等恶劣的条件下，于细胞表面形成特殊的保护膜，有效地保护生物分子结构不被破坏，从而维持生命体的生命过程和生物特征，可广泛用于生物制剂、医药、食品、化妆品及农业科学等各个行
7、业。通过液体深层发酵技术6,7可实现海藻糖的大规模生产，满足社会对海藻糖的需求。本研究目的是通过利用四种不同固体母种培养基培养灰树花，经过一系列液体发酵培养并测定发酵液中海藻糖产量，筛选利于生产的合理高效的母种培养基，促进海藻糖大规模生产制备工艺的发展。1 材料与方法1.1 菌种及培养基泰山灰树花 T1，由泰安农科院食用菌研究所提供。母种培养基：A ：PDA 培养基：马铃薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，琼脂 20 g，水加至 1000 ml，自然 pH；B：玉米粉综合培养基:玉米粉 50 g，葡萄糖 20 g，KH2PO4 2.0 g，MgSO4 1.0 g，琼脂 20 g，水加至 10
8、00 ml，自然 pH；C：马铃薯综合培养基：马铃薯 200 g，麦麸 50 g，葡萄糖 20 g，MgSO4 1.0 g，蛋白胨 5.0 g，琼脂 20 g，水加至 1000 ml，自然 pH；D：马铃薯板栗壳培养基：马铃薯（去皮）200 g，板栗壳 150 g（粉碎），葡萄糖 20 g，硫酸镁 1.0 g，磷酸二氢钾 2.0 g，琼脂 20 g，水 1000 ml。液体种子培养基：马铃薯（去皮）200 g，葡萄糖 20 g，蛋白胨 5.0 g，麦麸 50 g，KH2PO4 2.0 g，MgSO4 1.0 g，VB1 0.03 g，加水至 1000 ml，pH 自然。液体发酵培养基：马铃薯（
9、去皮）250 g，葡萄糖 30 g，麦麸25 g，KH2PO4 5 g，MgSO4 0.5 g，酵母膏 2.5 g，加水至 1000 ml。1.2 母种培养基初筛实验方法将斜面培养基塞好棉塞，7 支一把在棉塞外包扎一层牛皮纸捆扎好，装入手提式高压灭菌锅内灭菌后，制成斜面。待冷凝后在试管斜面中央接入 0.5 cm0.5 cm 大的灰树花活化菌丝块，接种块尽量要求一致。每一处理重复 5 次，置 2526 下恒温培养。观察记载菌丝的长速、长势、色泽、萌动时间、平均满管天数及污染情况等。1.3 种液制备及培养方法250 ml 三角瓶培养基装液为 50 ml，从四种母种培养基斜面菌种挖取小块活化菌种接种
10、于种子摇瓶，在 25 下于转速为 160 r/min 的旋转摇床上振荡培养 8 天，并观察记载菌株的长势、 色泽及污染情况。以 10的接种量将种子液接种到发酵摇瓶中，在同样的条件下发酵培养 10 天。发酵液用 4 层棉纱布过滤，分别测定菌体生长量及海藻糖含量。1.4 灰树花菌丝体中海藻糖的提取用双层纱布过滤，收集 50 ml 发酵液的菌体，蒸馏水将表面冲洗干净，取 1.0 g 湿菌丝加入 20 ml 0.5 mol/L 的三氯乙酸（TCA） ，冰水中冷浸 20 min 后，收集提取液，重复 3 次，合并提取液。1.5 菌丝体干重测定方法用双层纱布过滤收集发酵液中的菌丝体，蒸馏水冲洗表面至干净，
11、60 烘干至恒重，称干重。1.6 菌丝体海藻糖含量测定 海藻糖标准曲线的制备：用移液管分别精密吸取标准海藻糖溶液0，0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0 ml 于 7 支试管中，加水至2.0 ml，各管分别加入 0.2%的蒽酮硫酸试剂 4.0 ml（现配现用） 。摇匀，置冰水浴中冷却并放置室温。在 625 nm 处以首管做空白，测定其吸光值。以吸光值为纵坐标，海藻糖的浓度为横坐标绘制标准曲线，回归方程为: y = 0.2464x -0.0781， R2= 0. 9996。样品测定：取 2.0 ml 提取液按照标准曲线下的方法测定吸收值，计算样品中海藻糖含量。2 结 果2.1 不同固体
12、培养基上灰树花菌丝长势将灰树花母种在选定的 4 种培养基中培养，其菌丝生长状况不尽相同。试验从菌丝密度、菌落边缘整齐度、菌丝生长势及菌丝颜色等方面观察菌丝的生长状况，结果见表 1。 表 1 菌丝在4 种培养基上的生长状况表 1 表明，在培养基 D 上灰树花菌丝生长前端整齐，菌丝亮白，粗壮致密，长势旺；B、C 培养基上菌丝前端较整齐，菌丝较白，长势较旺；长势最差的是培养基A，前端生长不齐，灰白稀疏，长势弱，在四种培养基上均无污染。2.2 不同固体培养基上灰树花菌丝长速不同培养基间灰树花菌丝生长速度不同，从快到慢依次为DCBA，在培养基 D 上生长最快，日长速为7.5 mm，其次为培养基 C 和
13、B ，日长速分别为 6.5 mm 和 6.3 mm，生长最慢的是培养基 A，日长速为 5.5 mm。2.3 不同固体培养基上灰树花菌丝萌发和满管时间表 2 表明，灰树花菌丝在 4 种母种培养基中菌丝萌发和菌丝长满试管时间有差异。菌丝在培养基 D 中萌发最快，为 1.5 d，满管时间为 10.8 d，在 A 萌发最慢，为 3 d，满管时间最长，为 14 d。 表 2 4 种培养基的菌丝萌发和满管时间2.4 液体种子培养基中灰树花菌丝长势将上述四种母种培养基培养的灰树花接种于种子摇瓶，并观察记载菌株的长势、 色泽及污染情况。实验表明，在培养基 C 上生长的灰树花菌种在液体种子培养基中生长状况最好，
14、表现为菌丝球小，较密。其次为培养基 D，表现基本同培养基 C。培养基 B 菌丝球小但密集度稍低。培养基 A 上生长的菌种长势最差，表现为菌丝球大小不均且数量较少。2.5 发酵培养基中灰树花生长量及海藻糖含量的测定结果将上述种子液进一步通过摇瓶发酵测定灰树花菌丝生物量和海藻糖含量，结果见表 3。表 3 发酵培养基中灰树花生长量及海藻糖含量的测定结果从表 3 可以看出，在培养基 C 中培养的灰树花接种摇瓶生物量和产海藻糖量最高；其次是培养基 D 和 A培养基；通过培养基 B 培养灰树花接种摇瓶产海藻糖量最低。由此可确定在培养基 D（马铃薯板栗壳培养基）上不仅利于灰树花菌丝生长，而且也利于其代谢产物
15、海藻糖的合成。3 讨 论母种培养基筛选是灰树花液体发酵和人工栽培中的重要环节。对菌种进行母种培养基的筛选试验，有利于保证母种的质量。在母种培养基的筛选试验中，菌丝体的生长发育是鉴定环境是否合适的一个重要指标，为此，我们从菌丝的长势、长速、萌发情况三方面系统地研究了灰树花在不同固体培养基上的生长情况。实验结果证明，灰树花在四种不同的固体培养基上生长状况不同，在马铃薯板栗壳培养基上表现出较强的生长优势，菌丝长势优于其它培养基，此菌株在液体种子培养基中生长状况也较好，只是在发酵培养基中长势与预想有差别，原因有待进一步研究。通过深层发酵方法获得灰树花的菌丝体并提取其有效成分，与固体培养相比，具有原料来
16、源广泛、生产周期短、产量高等优点，可使灰树花生产工业化，已成为当前开发灰树花的重要手段。液体发酵中代谢产物的产量是筛选母种培养基的另一个指标。实验中我们研究了不同母种培养基对灰树花液体发酵产海藻糖的影响，结果发现在马铃薯板栗壳培养基上生长的灰树花进行液体发酵时产生海藻糖的量也很高，这说明板栗壳在母种培养基中可能作为一种生长因子对灰树花的生长和液体发酵中代谢产物的产生都起着一定的积极作用。综合各项指标来看，马铃薯板栗壳培养基对于海藻糖的实验室研究和大规模生产方面都有着明显的积极意义，对于灰树花的人工栽培也起着一定的借鉴作用。【参考文献】1吴锦文.贝叶多孔菌对自发性高血压症大鼠的血压升高具有抑制作用J.食用菌,2007, (5):51.2马迅,雷红,李谦,等.灰树花子实体多糖的分子组成与降血糖作用J.药物生物技术,2007, 14(5):328333.3马海萍,邝少松,钟志勇,等.食(药)用菌抗疲劳作用实验研究J.中国食用菌,2007,26(5): 3436.4罗明典. 微生物生产海藻糖及其应用前景J.微生
