泌尿系感染产超广谱泌尿系感染产超广谱 ββ 内酰胺酶内酰胺酶(ESBLs)(ESBLs)大大 肠埃希菌的耐药表型肠埃希菌的耐药表型 和基因分型和基因分型【关键词】 大肠埃希菌Resistant phenotype and genotype of extended spectrum βlactamase (ESBLs) produced in Escherichia coli isolated from urinary infectionsGENG Yan1, ZHANG WangGang1, WANG XiangLing1, YANG HuiBin2, HUANG Fang1, ZHANG Yi11Department of Clinical Laboratory, Second Hospital, Xian Jiaotong University, Xian 710004, China, 2Department of Transportation Management of Xian City, Xian 710065, China【Abstract】 AIM: To study the resistant phenotype and genotype of extended spectrum βlactamase (ESBLs) produced in Escherichia coli isolated from urinary infections. METHODS: Organisms of clinical infection were identified by automatic microbial system (Vitek) and the bacterial susceptibility was tested by KirbyBauer (KB) method as described in NCCLS. ESBLs was detected by disk diffusion confirmatory test and CTXM or SHV specific PCR were used to determine the genotype of ESBLs. RESULTS: 24.0% of E.coli produced ESBLs. Fortytwo of the 62 ESBLs producing strains (67.7%) expressed CTXM βlactamase and 9 of the 62 ESBLs producing strains (14.5%) expressed SHV βlactamase. CONCLUSION: ESBLs producers are mainly resistant to cefotaxime and cefiriaxone and most of them are multidrug resistant. Cefotaxime resistance is partially due to the production of CTXM βlactmase. CTXM βlactmase is most prevalent.【Keywords】 Escherichia coli; extended spectrum βlactamase; phenotype, antibiotics resistant; genotype【摘要】 目的:了解本地区泌尿系感染产超广谱 β 内酰胺酶(ESBLs)大肠埃希菌耐药表型及其基因型分布. 方法：收集200303/200406 间临床分离的尿培养阳性大肠埃希菌共 258 株, ESBLs 的检测采用 NCCLs 规定的 ESBLs 型筛选和确定实验，用KB 琼脂扩散法进行药物敏感性检测，并应用聚合酶链反应（PCR）方法对所分离的产 ESBLs 菌株进行 SHV, CTXM 基因型检测. 结果：产 ESBLs 大肠埃希菌检出率为 24.0%(62 株） ，67.7%(42 株)携带 CTXM 基因，14.5%(9 株) 的菌株携带 SHV 型基因，并有 1.6%(1 株)同时携带 CTXM 基因和 SHV 型基因. 结论：本地区泌尿系感染产 ESBLs 大肠埃希菌以耐头孢曲松和头孢噻肟为主; CTXM 型的 ESBLs 最为常见.【关键词】 大肠埃希菌；超广谱 β 内酰胺酶；表型,耐药；基因分型0 引言β 内酰胺类抗生素是临床抗感染治疗中使用最广的一类抗菌药物，产 β 内酰胺酶是细菌对此类抗菌药物耐药的主要机制，由质粒介导的超广谱 β 内酰胺酶（ESBLs）是导致革兰氏阴性杆菌对 β 内酰胺类抗生素耐药性的最重要机制，一旦这类酶由于某种机制而产生了大量由染色体或质粒介导的 β 内酰胺酶（青霉素酶、头胞菌素酶、碳青酶烯类酶等） ，则可使包括第三代头胞菌素在内的许多 β 内酰胺类抗生素失活，成为目前临床治疗感染性疾病的重大难题. 为了解本地区泌尿系感染产 ESBLs 大肠埃希菌耐药表型和基因型分布特征,我们对临床标本中所分离到产 ESBLs 大肠埃希菌进行分子生物学研究.1 材料和方法1.1 材料收集 200303／200406 西安交通大学第二医院细菌室临床尿培养分离的大肠埃希菌共 258 株. 培养基:MuellerHinton琼脂，羊血营养琼脂购自上海医化所，ESBLs 的阳性质控菌株肺炎克雷伯菌 ATCC700603. 药敏实验质控菌株：大肠埃希菌E.coli ATCC25922. 药敏纸片：阿米卡星(AN)、复方磺胺 (SXT)、呋喃妥因（F） 、环丙沙星(CIP)、左旋氧氟沙星（LEV） 、头孢唑啉（KZ） 、头孢呋新（CXM） 、头孢噻肟(CTX)、头孢曲松（CRO） 、头孢他啶(CAZ)、氨曲南(ATM)、头孢西丁(FOX)、头孢吡肟(FEP)、亚胺培南(IMP)、头孢哌酮／舒巴坦（SCF） 、替卡西林／克拉维酸(TIM)、哌拉西林／ 三唑巴坦(TZP) 、头孢他啶／ 克拉维酸(CD02)、头孢噻肟／ 克拉维酸(CD03)，纸片为英国 OXOID 公司产品. 每周用质控菌株进行质量控制.1.2 方法1.2.1ESBLs 的检测采用全自动微生物分析仪 Vitek GNI+卡对所分离菌株进行鉴定. 抗生素敏感性试验采用纸片扩散法即 KB 法，大肠埃希氏菌 ATCC25922 做药敏质控. 药敏结果按 NCCLS 标准进行判定（S, I, R）. 按 1999 年 NCCLS100S10 推荐的方法进行超广谱 β 内酰胺酶 ESBLs 的检测和判定，采用纸片扩散法，包括筛选和确认实验两步. 选用头孢他啶、头孢噻肟两种药敏纸片（30 μg/片） ，凡头孢他啶≤22 mm、头孢噻肟≤27 mm，均应进一步作确认. 当头孢他啶（30 μg/片）与头孢他啶/棒酸（30 μg/10 μg）或头孢噻肟（30 μg/片）与头孢噻肟/棒酸（30 μg/10 μg）中任意一组药物的抑菌环直径相差≥5 mm，可确认为 ESBLs 阳性菌株. ESBLs 的质控菌株大肠埃希菌ATCC25922（头胞他啶与头胞他啶+克拉维酸相差≤2 mm）肺炎克雷伯菌 ATCC 700603（头胞他啶与头胞他啶+克拉维酸相差≥5 mm）.1.2.2PCR 试验取单个菌落接种于 5 mL LB 肉汤，37℃振荡培养20 h. 取 1.5 mL 菌悬液在 4℃以 650 g 离心 5 min，弃上清. 加入 500 μL 的无菌去离子水，振荡混悬. 95℃水浴加热 10 min，4℃ 650 g 离心 5 min，上清即为制备的模板 DNA. 在Genbank 里利用 Primer3.0 设计引物. 引物序列为：左侧引物5′CGCCTGTGTATTATCTCCCTGT3′，右侧引物5′TTAGCGTTGCCAGTGCTC3′. CTXM 型酶引物序列为：左侧引物5′AAAAATCACTGCGTCAGTTCA3′，右侧引物5′TTACAAACCGTTGGTGACGA3′. 引物由上海生工生物技术有限公司合成. PCR 反应总体积为 50 μL，其中 10×Buffer 为 5 μL；dNTP 混合物，各组分 0.2 mmol/L；Taq 酶 2 U；左右侧引物各 0.5 μmol/L；MgCl2 浓度为 2.0 mol/L；模板 2 μL. 在加入 Taq 酶前，首先在 95℃预变性 10 min. PCR 循环条件为93℃变性 1 min，55℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，共 30 循环. 琼脂糖电泳：在电压为 4 V/cm2 条件下电泳 35 min，紫外灯下观察结果，并用凝胶成像系统照像.统计学处理: 应用 SPSS 11.0 软件进行统计学分析（包括Fisher 精确概率法、χ2 检验）. P<0.05 认为差异有统计学意义.2 结果泌尿系感染产 ESBLs 大肠埃希菌的分离率在门诊和住院有差异（P<0.05, Tab 1）. 泌尿系感染大肠埃希菌产 ESBLs 与 ESBLs阴性菌的耐药性（Tab 2）：ESBLs 阳性与 ESBLs 阴性的大肠埃希菌两者的耐药率（包含中介）差异有统计学意义(P<0.05). 62 株产 ESBLs 大肠埃希菌的分子生物学初步分型结果显示：67.7%(42 株)携带 CTXM 基因，14.5%(9 株) 的菌株携带 SHV 型基因，并有 1.6%(1 株)同时携带 CTXM 基因和 SHV 型基因. 研究提示本地区泌尿系感染产 ESBLs 大肠埃希菌的主要基因型为CTXM 基因，同一菌株可能同时携带多种质粒介导的 ESBLs，导致其耐药基因的复杂性.表 1－表 2 (略)3 讨论自从 1983 年在德国从臭鼻克雷伯杆菌中分离出 SHV2 型 ESBLs以来，大量的新型 ESBLs 从不同的细菌、不同的国家和地区分离出来，导致 ESBLs 在地区间的分布呈现明显的差异性［1］,在西安地区泌尿系感染患者尿培养的大肠埃希菌株中 ESBLs 的检出率达 26.05%,与国内其他地区的平均水平相当［2,3］.文献报道 ESBLs 不能水解头霉素类，但本研究结果提示，对于产 ESBls 菌株头孢西丁仍有近 40％产生耐药，这可能与细菌细胞外膜的改变或细菌同时产生 AmpC 酶有关［4-5］. 尽管NCCLS 明确指出对 ESBLs，不管其体外药敏试验结果如何，都应被视为对所有头孢菌素类抗生素耐药［6］ ，头孢吡肟对于产ESBLs 的抗菌活性文献报道不一，但由于头孢吡肟具有更强的细胞膜穿透性、对酶的低亲和性和对酶更强的稳定性等特点［7］ ，大部分认为其对高产 AmpC 酶菌株具有强大的抗菌活性［8］ ，但对同时携带 ESBLs 的阴沟肠杆菌应谨慎应用.在体外药敏试验中,产 ESBLs 菌对氨基糖甙类、磺胺类和喹诺酮类抗生素的耐药亦相当严重，与国外报道相比［9］ ，产 ESBLs菌对氟喹酮类抗生素的敏感性明显低，左旋氧氟沙星和环丙沙星耐药率超过 60%，这与临床泌尿系感染更习惯选择氟喹酮类抗生素有关. 其原因可能由于产诱导酶的细菌通过 DNA 转移酶变异和外膜蛋白通透性降低而导致对喹诺酮类抗菌药物耐药，同时这与产 ESBLs 菌株在携带有 ESBLs 的质粒上可同时携带有多个对氨基糖甙类、喹诺酮类和磺胺类等抗生素的耐药基因有关［10］.本研究中，对可疑菌株进行 ESBLs 表型确证试验，98 株细菌为产 ESBLs 菌，其中仅表现为 CD02 抑菌圈直径比头孢他啶的增大值≥5 mm 的菌株有 8 株，仅表现为 CD03 比头孢噻肟的抑菌圈直径增大值≥5 mm 的有 38 株，两者同时具有的为 16 株. 说明本地区检测到的 ESBLs 的水解底物主要为头孢噻肟，头孢他啶在体外对产 ESBLs 菌的抗菌活性要比头孢噻肟强.根据 ESBLs 的同源性可分为 TEM 型、SHV 型和 CTXM。