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1、晚期糖化终末产物在糖尿晚期糖化终末产物在糖尿 病大鼠骨质疏松发病中的病大鼠骨质疏松发病中的 作用作用中国老年学杂志 2000 年第 5 期第 20 卷 实验研究作者:孔德娟 李恩 陈永春 佟晓旭单位:河北医科大学生化教研室,石家庄 050017关键词:晚期糖化终末产物;糖尿病性骨质疏松;骨密度摘 要 目的 探讨晚期糖化终末产物(AGE)在糖尿病骨质疏松发病中的作用。方法 用链脲佐菌素制做糖尿病大鼠模型,3 个月后测定大鼠腰椎骨密度及骨胶原中 AGE 的含量及观察血、尿生化指标的变化。结果 糖尿病大鼠骨胶原中 AGE 的含量与正常对照组相比明显升高(P0.001),而骨密度明显降低(P0.02)
2、。24 h 尿钙增加,血钙降低。结论 糖尿病大鼠骨胶原中 AGE 含量的增加所导致的成骨作用降低,可能是糖尿病骨质疏松发病的主要原因。晚期糖化终末产物(AGE)是糖的醛基或酮基与蛋白质等自由氨基,在非酶促反应中首先形成可逆的希夫氏碱(Schiff-base),再经一系列脱水、氧化等反应,形成一类具有特征性荧光的化合物1 。血糖的增加及富于自由氨基的蛋白质则有助于该物质的形成。糖尿病患者,由于胰岛素相对或绝对不足引起血糖升高,是 AGE 形成增加的主要原因2 。而骨胶原中的大量自由氨基,是 AGE 的主要形成部位。蛋白质一旦经糖化终末产物修饰,则改变其生物学活性3 。而在骨形成过程中,成骨细胞对
3、骨组织中型胶原的吸附是骨形成开始的先决条件。因此,本文通过测定糖尿病大鼠骨胶原中 AGE 含量及糖尿病大鼠的骨密度,探讨糖尿病骨质疏松的发病机制。1 材料和方法1.1 实验动物 实验选用体重 200250 g Wistar 大鼠20 只。适应环境 1 w 后,随机分为 2 组,即正常对照组、病理模型组。病理模型组以 60 mg/kg 体重链脲佐菌素(溶于柠檬酸缓冲液中 pH4.5)经腹腔注射。正常对照组注射等量柠檬酸缓冲液,普通饲料喂养,自由饮用自来水,1 w 后,尾静脉取血,测定血糖,血糖浓度15 mmol/L 被选入实验。常规喂养 80 d后,禁食 24 h 收集尿液。大鼠经股动脉放血收集
4、血液,离心取血清待测。取大鼠腰椎 L1L4 做骨密度测定,取右侧股骨和胫骨放-70冰箱,用于测定骨胶原中 AGE 相对含量。1.2 血尿生化指标的测定 血钙、血磷、血糖、血碱性磷酸酶、尿钙、尿磷、尿肌酐均采用全自动生化分析仪检测,尿羟脯氨酸采用氯氨 T 氧化比色法测定。1.3 骨密度和骨胶原 AGE 的测定 采用 SD1000 骨矿物测定仪测定大鼠第三腰锥(L3)骨密度。骨胶原中 AGE 含量的测定:从-70冰箱取出骨标本后,沿骨纵轴剪开,用冰冷的PBS(pH7.4)冲洗骨髓腔数次直至冲洗液 PBS 无红色为止。滤纸吸干水份后,放入液氮中,30 min 后取出,在研钵中用力研磨,过 20 目不
5、锈钢筛,称取 20 目以下的骨颗粒 20 mg,在 0.5 M EDTA(pH7.4)中,4脱钙 72 h,每 24 h 换液一次。脱钙骨粉经 5 ml 氯仿甲醇(21VV)脱脂 12 h。加入甲醇 2 ml、蒸馏水 0.5 ml,650 g 离心 10 min。吸弃上清,沉淀经 5 ml 甲醇洗 2 次,去离子水洗 3 次,再用含 0.1 mol/L CaCl2 的 0.02 mol/L Hepes 缓冲液(buffer H pH7.5)洗 2 次。Buffer H 中4过夜。离心,除去 Buffer H,骨颗粒沉淀重新悬浮在 1.0 ml 含 280 U胶原酶的 Buffer H 中,同时
6、加入 2 l 氯仿和 2 l 甲苯以防细菌生长,水浴摇床中 37消化 24 h。10 000 g离心 5 min。以激发波长 370 nm,发射波长 440 nm 处测定上清中的荧光强度,含胶原酶的 buffer H 作空白对照。上清再经6 mol/L 盐酸 110水解 24 h 后,用于羟脯氨酸的测定。以胶原中羟脯氨酸的含量为 14%,计算出胶原含量。AGE 的含量以每毫克胶原中相对荧光强度(RF/mg)表示。1.4 统计学分析 所有数据均以 xs 表示,数据用计算机统计软件 PSI 运算处理。2 结 果2.1 血、尿生化指标的变化 病理模型组与正常对照组相比血钙明显降低(P0.05),尿钙
7、明显增加(P0.05),而血碱性磷酸酶显著升高(P0.001)(表 1)。病理模型组与对照组相比血糖显著升高(P0.01),病理模型组血糖在注射链脲佐菌素(STZ)7 d 后和 90 d 无统计学差异(表 2)。表 1 血、尿生化指标的变化(s)组别 n 血 Ca(mmol/L)血 P(mmol/L)血 ALP(IU/L)尿 Ca(mol/24 h)尿羟脯氨酸(mol/24 h)正常对照组102.460.071.990.4150.813.364.60.291.040.43 病理模型组 82.210.251)1.600.52205.551.372)24.07.401)1.270.36 注:病理组
8、与对照组相比:1)P0.05,2)P0.001 表 2 各组大鼠血糖的变化(s,mmol/L)组别 n 注射 STZ7 d 注射 STZ90 d 正常对照组104.50.64.50.6 病理模型组 820.21.71)18.01.91) 病理模型组与正常对照组相比:1)P0.012.2 骨密度及 AGE 的变化 链脲佐菌素所致糖尿病大鼠(即病理模型组)与正常对照组相比,骨密度明显降低(P0.02),同时骨胶原中 AGE 的相对含量显著增加(P0.001)(表 3)。表 3 大鼠骨密度与骨胶原中 AGE 的含量(s,mmol/L)组别 nBMD(g/cm)AGE(RF/mg 胶原)正常对照组10
9、0.2710.02630.964.63 病理模型组 80.2390.0241)60.119.742) 病理组与正常对照组相比:1)P0.02,2)P0.0013 讨 论血糖升高及蛋白质自由氨基的多少都影响 AGE 的形成,链脲佐菌素所致的糖尿病大鼠血糖明显升高,而且没有明显的自然恢复,也即出现持续高血糖状态。因此,在各种组织蛋白上极易发生非酶糖化反应,形成 AGE,尤其是含自由氨基较多的长寿命蛋白,如骨胶原、鼠尾腱、皮肤及肾小球基底膜等47 。由于这些蛋白半寿期较长,AGE 一旦形成,则不易清除。骨基质中的型胶原的功能正常是骨重建的先决条件。有研究表明:非酶糖化的细胞外基质对内皮细胞的粘附能力
10、降低8 。推测非酶糖化的型胶原对成骨细胞的粘附能力也可能降低,成骨细胞的粘附是成骨作用的开始。而非酶糖化产物AGE 修饰的骨基质对成骨细胞分化的抑制则导致成骨作用明显降低9 。这与糖尿病患者血清骨钙素降低结果相一致。但在本实验中糖尿病大鼠血清碱性磷酸酶(ALP)的明显升高,原因可能为链脲佐菌素造成肝损伤而致 ALP 升高,而非骨形成增加所致,因所测转氨酶明显升高(本资料未显示)。AGE 不仅使成骨作用降低,同时相对增加骨吸收。AGE 修饰的蛋白对单核巨噬细胞具有趋化作用,而后者细胞膜上存在着AGE 受体。AGE 在受体介导下与单核巨噬细胞结合,促进后者合成和释放多种细胞因子,如 IL-1、IL
11、-6、TNF- 等1014 。这些细胞因子通过直接或间接途径促进破骨细胞前体细胞转化为成熟的破骨细胞,并增加其骨吸收活性1517 。因此,AGE 的升高可导致骨吸收相对增加,骨形成作用降低,从而导致骨量丢失。本研究中发现糖尿病大鼠骨胶原中 AGE 明显升高,骨密度则明显降低。综上所述,糖尿病时的 AGE 升高可能是导致糖尿病骨质疏松的主要原因。作者简介:孔德娟,女,35 岁,讲师,博士,研究方向:糖化终末产物与老年疾病参考文献1,Vlassara H,Bucala R,Striker L.Biology of disease:Pathogenic effects of advanced gly
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