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1、晚期糖基化终末产物的检晚期糖基化终末产物的检 测和临床意义测和临床意义国外医学临床生物化学与检验学分册 1999 年第 20 卷第 6期白求恩医学大学基础医学院（长春 130021）候芳玉 郭焱综述白求恩医科大学应用基础医学研究所（130021）李才审校摘要 晚期糖基化终末产物（advanced glycosylation end prodrcts, AGEs）在糖尿病慢性并发症发病中起重要作用。近年来 AGEs 作为监视伴慢性并发症糖尿病病人治疗效果的一项重要指标，正被认识并在临床应用。本文介绍 GAEs 的形成过程、化学结构、检测方法和临床意义。关键词：晚期糖基化终末产物；检测方法；糖尿病
2、慢性高血糖是诱发糖尿病慢性并发症的始动因素。近年大量研究证明，在高血糖状态下蛋白质发生的非酶糖基化在糖尿病慢性并发症的发病中起重要作用1。血清和组织中晚期糖基化终末产物（AGEs）水平与糖尿病慢性并发症的程度明显相关，阻止糖基化反应可减少 AGEs 形成，减少或减轻并发症。血清或组织 AGEs 浓度已作为监视糖尿病，尤其是伴有肾脏损害及血管并发症病人治疗效果的一项新指标2。因此，准确测定血清和组织中 AGEs 浓度，判断病人体内 AGEs 蓄积程度具有重要临床意义。1 非酶糖基化反应蛋白质非酶糖基化是指在无酶催化条件下，葡萄糖分子游离醛或酮基与蛋白质氨基通过亲核加成反应形成糖基化蛋白的过程。早
3、期形成可逆的 Schiff 碱，后者经结构重排形成较稳定的酮胺化合物（Amadori 产物） ，再经过脱水、氧化和缩合等反应，最后形成稳定的、不可逆的 AGEs。这一反应最早由法国生物化学家 Maillard 描述，故又称为 Maillard 反应。除葡萄糖外，其它还原糖类如果糖、葡萄糖-6-磷酸和核糖等也可使蛋白质糖基化。而且由于开链结构的关系，它们使蛋白质糖基化的速度明显比葡萄糖快。一般认为，AGEs 常发生在长寿蛋白上，如胶原蛋白和晶体蛋白等。近年证明，AGEs 也可在一些短寿蛋白、核酸、脂质成分和脂蛋白上形成3。2 AGEs 的化学结构和共同特点AGEs 呈异质性，分离时不稳定，使 A
4、GEs 化学结构研究遇到不少困难，迄今 AGEs 的实际化学结构尚不清楚。体内已被鉴别出来的糖基化产物主要有：2（2-furoyl）-4（5）-（2-furanyl）-1H-imidazole（FFI）alky-formyl-diglycosylpyrrole（AFGP）pyrraline、羧甲基赖氨酸（Carboxy-methyl-lysine, cML）和戊糖苷（pentosidine） 。但目前尚无充分证据证明它们就是体内 AGEs 存在的真实形式。CML 系果糖赖氨酸氧化裂解的产物。戊糖苷是一个赖氨酸和一个精氨酸残基与一个咪唑-（4,5b）-吡啶翁环的结合物。有研究证明，CML 是抗
5、AGEs 抗体识别的主要结构。虽然 AGEs 的实际化学结构尚不清楚，且呈异质性，但它们具有至少一个共同的结构成分和共同的抗原决定簇。AGEs 的共同特点是，不可逆性，呈棕褐色，具有特征性荧光光谱和同蛋白质等大分子形成交联的能力（交联性） 。3 AGEs 的检测方法由于 AGEs 化学结构不明和呈多样性，而且无商品试剂盒可供临床使用，因此血清和组织 AGEs 水平的检测尚有一定困难。检测 AGEs 的主要方法有：（1）放射免疫分析法。它检测 AGEs的灵敏度高，但对抗 AGEs 抗体纯度的要求很严格；（2）放射受体分析法。本方法的特异性、精确性和重复性均很好，但检测时须用较大量放射性同位素，易
6、造成环境污染，故在普通实验室难以应用；（3）荧光光谱法。AGEs 在 Ex370/Em440nm 有特征性吸收光谱，故荧光光谱分析是测定 AGEs 较常用的方法，通过荧光测定可大致估计体内 AGEs 的实际水平，可能与 AGEs的变化趋势，但有时会低估 AGEs 的的实际水平，可能与 AGEs的有些结构不具有荧光性质有关。由于体内尚存在其他荧光物质，可能影响 AGEs 的荧光测定，故荧光光谱法测定 AGEs 尚缺乏特异性。戊糖苷在 Ex338/Em385nm 波长下有特征性光谱，可用以测定戊糖苷水平；（4）酶免疫法。本法是近年来发展起来的 AGEs 检测技术，具有特异性高、精确性好、简便、快速
7、和可在普通实验室应用等优点，已成为目前检测 AGEs 的常用方法。但抗体制备和分析方法的标准化等问题尚有待提高。以下主要介绍用酶免疫技术检测 AGEs 的有关问题。4 测定 AGEs 的酶免疫技术4.1 AGE 修饰蛋白质（免疫原）的制备由于 AGEs 的化学结构尚未阐明，很难获得其真正纯品，因此难以直接用 AGEs 作为免疫原。目前多使用在体外糖基化体系（含葡萄糖等还原糖和蛋白质）中制备的 AGE 修饰蛋白质（AGE-Protein）作为免疫原。早年 Nakayama 等用 AGE 修饰钥孔 血蓝素（Keyhloe limpet hemocyanin, KLH） 、牛血清白蛋白（BSA）和核
8、糖核酸酶（RNase）作为免疫原，免疫豚鼠制备出抗 AGE 多克隆抗体，并证明这些抗体对 AGEs 的共同抗原决定簇是特异的，而与早期糖基化产物不发生反应。此后，Horiuchi 等用 AGE 修饰BSA（AGE-BSA）作为免疫原，制备了抗 AGE 多克隆抗体和单克隆抗体。这些抗体与 AGE 修饰的几种蛋白质均发生反应，而与FFI 及 pyrraline 不发生反应，证明 AGEs 中确实存在共同结构。但这种共同结构是什么，迄今未被阐明。已经证明，在多种 AGE 修饰的蛋白质中，以 AGE 修饰核糖核酸酶（AGE-Rnase）作为免疫原免疫动物产生和抗体效价高，特异性强4。AGE-Rnase
9、 的制备：一般用 25mg45mg rnase与 1mol/L 葡萄糖溶于 0.2mol/L 磷酸盐缓冲液（Ph7.4）中，除菌后 37，暗处孵育 90 天。制备包被等用的 AGE-BSA 则用50mgBSA 与 0.5mol/L，葡萄糖溶于 0.2mol/L 磷酸盐缓冲液（Ph7.4）中，除菌后 37，暗处孵育 60 天4。4.2 抗 AGE 多克隆抗体的制备4 由于以 AGE 修饰蛋白质作免疫原的特殊性，制备抗 AGE 抗体的方法与一般制备抗体的方法有所不同。AGE-Rnase 与完全福氏佐剂等量乳化后，经家兔皮内多点注射，每周 1 次，共 4 次。休息 2 周后，将 AGE-Rnase
10、与不完全福氏佐剂等量乳化，加强注射 1 次。末次注射后 10 天采血分离血清，检测抗体效价。我们用上述方案制备抗AGE 抗体时，基础免疫共进行 6 次，如强免疫 1 次，所得抗体效价较理想5。为获得高效价、高亲和力的抗体，所用的抗原要纯，免疫过程不能急于求成。原则上应以小量抗原多次注射，较长时间免疫动物。我们体会，由于免疫过程的长短和动物个体差异等原因，所得抗血清的效价往往相差甚大5。4.3 用竞争性 ELISA 检测 AGEs 用竞争性 ELISA 检测血清和组织中 AGEs 水平是目前最常用的方法。其基本原理是：固相抗原 AGEs（AGE-BSA）与待测标本中 AGEs 竞争地结合有限量的
11、抗体（抗 AGE-Rnase 抗体） ，结合到固相上抗体的量与标本中AGEs 的量呈逆相关。基本操作步骤是，用 AGE-BSA 包被酶标测定板，封闭，加入待血清和标准物（AGE-BSA） ，再加入抗 AGE-Rnase 抗血清，最后加入碱性磷酸酶（ALP）标记的羊抗兔 IgG和酶作用底物，显色后用酶标测定仪测定吸光度。有人用时间分辨荧光分析法检测血清 AGEs 浓度。其原理同竞争性 ELISA 法，只是把 ALP 的作用底物改为 5-氟水杨酸磷酸酯（FSAP） ，后者在 ALP 作用下水解为 5-氟水杨酸（FSA） 。FSA与三价铽（Tb3+）形成具有强荧光的三元螯合物，再在时间分辨荧光分析仪
12、上测定其荧光值。竞争性 ELISA 也可用于测定循环中血红蛋白-AGE（Hb-AGE） 。Hb-AGE 是体内组织被 AGEs 长期修饰的标志，它作为更长期的血糖控制状况的指标比 HbAlc 更优越6，有可能作为一项新的糖基化指标在临床上应用。4.4 AGEs 的表示单位和标准化 目前使用竞争性 ELISA检测 AGEs 最大的限制是，尚无通用的 AGEs 表示单位和绝对标准。以往用两种方法定义 AGEs 单位：一种是 AGE-蛋白质浓度法，即 1U aGEs 等于 1g AGE-BSA 的 B/Bo试验管 OD-背景OD（不加抗 AGE 抗血清）/总 OD（不加标准 AGE-BSA）-背景O
13、D。另一种是 50抑制法，即将引起抗 AGE 抗体结合到吸附AGE-蛋白达 50抑制的 AGEs 量，定义为 1U aGEs。这两种表示AGEs 单位方法的主要缺陷是，不同批次或不同实验室所测得的AGEs 结果难以比较。为克服上述缺陷，Mitsuhashi 等7提出用正常人血清（NHS）来标准化 AGEs 测定。因为 NHS 中 AGEs 水平处在狭窄的范围，可用正常人血清平均 AGEs 值作为通用的AGEs 测定标准。NHS 法定义的 AGEs 单位是在竞争性 ELISA 中等于 1：5 稀释的 NHS 引起抑制的量，即 NHS 中 AGEs 值被定义为5U/ml。用 NHS 法定义 AGE
14、s 单位的优点是，NHS 中 AGEs 是自然形成的。不象前述两种定义方法，此法定义 AGEs 单位不取决于吸附性抗原和 AGE-蛋白质，也不取决于抗 AGE 抗体。而且这种标准品易于获得，所测得 AGEs 值在测定批次之间或实验室之间具有可比性。4.5 抗 AGEs 单克隆抗体由于单克隆抗体（单抗）具有高度特异性和均一性，抗 AGE 单抗可能比抗 AGEs 多克隆抗体（多抗）优越。然而，由于 AGEs 呈多样性，其真实化学结构不明，抗AGEs 单抗不能识别目前已提到的一些 AGEs 结构。另外，单抗仅能识别单一抗原位点，进行微量抗原（如 AGEs）检测时，其灵敏度往往不如多抗。我们的研究也证
15、明，用 AGEs 单抗测定血清 AGEs 时灵敏度不及多抗。但在免疫组织化学研究中，AGEs单抗似优于多抗。4.6 组织中 AGEs 定量和定位 应用抗 AGEs 抗体和竞争性ELISA 法可测定组织中 AGEs 水平，检测前组织标本须进行预处理3。利用抗 AGEs 单抗或多抗及免疫组织化学方法，可对组织中 AGEs 的分布进行定位检查。5 AGEs 的致病作用和临床意义AGEs 具有广泛的致病作用。AGEs 形成后引起蛋白质分子间广泛交联，致使蛋白质结构、机械强度、溶解性和配位结合等性质均发生改变。体内多种蛋白质糖基化可从多个方面影响机体，如引起血管通透性增大、血管基底膜增厚和细胞外基质积聚
16、等。AGEs 与其细胞表面受体（RAGE）结合，通过趋化和活化单核巨噬细胞，激活转录因子 NF-KB，促进细胞因子和组织因子的释放，灭活一氧化氮和产生氧自由基等途径，参与糖尿病慢性并发症的发生和发展3,8,9。由于 AGEs 的不可逆性，即使高血糖被纠正后，AGEs 水平也不能回复到正常，而继续在组织中累积。从组织 AGEs 自然解释出的反应中间物，如不能经肾脏消除，可再次结合到其他结构上，发生 AGEs 的“第二次”或“第三次”生成3。糖基化反应在正常机体即缓慢进行，AGEs 水平随年龄增长而缓慢增加。但在老化过程，特别是在糖尿病持续高血糖情况下，这一反应的速度显著加快，AGEs 形成量明显增多。现已证实，AGEs 在动脉粥样硬化、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、早老性痴呆（Alzheimer 氏病）和老化性病变的发生中起重要作用10。体内 AGEs 慢性蓄积与动脉粥样硬化之间有明显因果关系，AGEs 能启动和/或加重动脉粥样硬化，而不取决于糖尿病或血脂异常11。血清 AGEs 水平与糖尿病肾病早期
