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1、显微注射受精的卵母显微注射受精的卵母 细胞质膜穿破类型与细胞质膜穿破类型与 受精和卵裂的关系受精和卵裂的关系中华妇产科杂志 1999 年第 11 期第 34 卷 论著摘要作者：李蓉 庄广伦 周灿权 张敏芳单位：510080 广州，中山医科大学附属第一医院生殖医学研究中心自 1995 年 12 月,我院生殖医学研究中心开始采用卵母细胞单精子显微注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI) 治疗严重男性因素及不明原因不育患者，至 1998 年 1 月 16 日，我中心已采用 ICSI 技术共治疗了 156 个周期的不育患者1 。目前对影响 ICSI 结果的因素
2、了解不多， ICSI 的关键是将一条制动精子通过穿破的卵膜置于卵母细胞胞浆内,但卵膜的穿破形式因人而异,甚至因不同的卵母细胞而异,这通常取决于操作技术环节和卵母细胞自身的特性。为此,我们就不同卵膜穿破形式对卵子的受精、卵裂情况的影响进行分析。一、资料与方法1.研究对象：为 1995 年 12 月至 1998 年 1 月,在本中心接受 ICSI 治疗的 156 个周期的不育患者(152 例)，女方平均年龄为（31.23.8）岁(2342 岁),男方平均年龄为（33.94.8）岁(2654 岁),平均不育时间为（6.32.8）年(215 年)。适应证为严重少、弱、畸精症或前次体外受精（IVF）周期
3、的受精率低（20%） 、阻塞性无精症患者2 。2.方法：（1）卵母细胞及精液处理：控制性促排卵采用本中心常规体外受精-胚胎移植(IVF-ET)方案3 ，注射人绒毛膜促性腺激素（hCG）36 小时后，B 超指导下经阴道取卵。取卵46 小时，将卵母细胞置于透明质酸酶溶液中，进行去卵丘结构处理，选择成熟的卵母细胞进行 ICSI 受精，精液采用 Peroll 梯度离心法。根据显微注射过程中卵膜穿破的不同,将注射的成熟卵母细胞分为 3 组,A 组：共 307 个卵，显微注射针穿刺卵母细胞膜过程中,注射针直接进入胞浆内,无需回吸胞浆；B 组：共 769 个卵，注射针穿刺到胞浆深部时,轻微回吸少许胞浆,卵膜
4、即穿破；C 组：共 405 个卵，注射针穿刺到胞浆深部时,用力回吸一定量胞浆,卵膜才穿破。 （2）观察项目：应用英国 RI公司的显微操作仪及显微注射仪，注射 1518 小时后，检查有无原核，4060 小时后观察卵裂，将胚胎分为两级，a 级为无核碎片50%，b 级为无核碎片50%。经阴道宫腔内移植质量优良的胚胎 4 个。移植后 2 周进行妊娠试验，7 周后 B 超检查有无胎心搏动。3.统计学处理：采用 2 检验。二、结果3 组卵子存活率差异有显著性（P0.05） 。操作过程中，A组的卵子存活率最低（72.6%） ，B、C 组卵子存活率分别为 91.7%及90.6%（P0.05） ，总卵子存活率为
5、 87.4%。以存活卵子计算受精率，3 组分别为 66.8%、68.5%及66.2%（P0.05） ，总受精率为 67.6%（见表 1） 。表 1 卵膜穿破不同类型与受精和卵裂的关系组别卵子数（个）存活卵子正常受精卵裂数个数百分比（%）个数百分比（%）a 级(%)b 级 (%)A 组307223*72.614966.856*（42.0）77*（58.0）B 组76970591.748368.5339(77.9)96(22.1)C 组40536790.624366.2161（73.5）58（26.9）合计 14811295 87.487567.6556(70.6)231(29.4)与 B、C 两
6、组比较，* P0.05 * P0.01A 组的 a 级卵裂球数量最少，只有 42.0%，B 组最高，为77.9%，C 组为 73.5%，A 组与另两组的 a 级卵裂球数量比较，差异有极显著性(P0.01)。三、讨论在注射精子的技术和卵的质量均等的前提下，影响卵膜穿破的两个重要因素是卵膜的张力（或弹性）以及显微注射针的质量，另外透明带的硬度也会影响卵膜的穿破形式4 。如果透明带较硬或注射针相对较粗而钝，将会在卵膜被刺破之前，透明带被注射针压迫成深陷入胞浆的八字型，当透明带最终被刺破时，注射针在瞬间“跃入”胞浆，从而出现 A 组的卵膜穿破类型，由于卵母细胞被压迫成八字型，再加上注射针突然刺入胞浆，
7、细胞的显微结构被破坏，可能是 A 组卵子存活率低下的原因之一。但在多数的情况下，透明带的穿破是不成问题的，故卵膜的穿破形式主要取决于卵膜的张力。卵膜的脆性越大就越容易导致 A 组的穿破类型。如果注射针一接触到卵膜，无需压迫，卵母细胞的卵膜就被穿破，这些卵母细胞多数立即变黑以致死亡，即使存活也不受精，这是 A 组卵子存活率低下的另一个主要原因。机械性去卵丘过程也是决定卵膜穿破类型的因素之一。洗卵针的口径太小，对卵母细胞的压迫太强，将损伤细胞的骨架结构，也是导致 A 组类型穿破的原因之一。B、C 组穿破的卵母细胞，卵子存活率明显高于 A 组，提示对卵膜的适当压迫后再进入胞浆的操作过程，有利于注射针
8、回抽后卵膜的闭合，因为在这种情况下，卵膜的破口是在近胞浆的内侧，当注射针回抽时，被压迫的部分在缓慢回弹过程中，有更多的时间让卵膜回复其完整性。在 C 组穿破类型中，若注射针穿刺太深或针尖的“鹰嘴”太长，都有可能穿到对侧的卵膜，导致细胞死亡。本研究结果提示，受精是一个不依赖于卵膜穿破类型的过程，主要取决于存活卵子的激活与否，以及精子是否成功注射到胞浆内。卵裂球的质量则以 B 组类型穿破形式为最好，A 组类型最差，提示不同的卵膜穿破形式将影响受精卵的进一步发育，其中一个原因可能是 B 组类型穿破形式的操作过程比较柔和，而另两种类型的损伤较大，影响了细胞的骨架结构，导致一些不规则的分裂。总之，卵膜穿
9、破不同类型将影响卵子的存活以及受精卵的进一步发育，但对存活卵子的受精率影响不大。参考文献1 李蓉，庄广伦，张敏芳. 卵母细胞单精子显微注射治疗男性因素及不明原因不育. 中华妇产科杂志，1997,32:211-213.2 李满，庄广伦，李蓉，等.卵浆内单精子注射术治疗阻塞性无精症不育症.中山医科大学学报，1998，19：131-132.3 庄广伦，周灿权，张秀俊，等. 体外受精与胚胎移植34 例报告. 生殖医学杂志， 1992,1:24-25.4 Nagy ZP, Liu J, Joris H, et al. The influence of the site of sperm deposition and mode of oolemma breakage at intracytoplasmic sperm injection on fertilization and embryo deve- liopment rates. Hum Reprod,1995,12:3171-3177.(收稿：1998-12-09 修回：1999-08-18)
