《微生物工程实验学号09121047曹运鹏》由会员分享，可在线阅读，更多相关《微生物工程实验学号09121047曹运鹏（5页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、黑曲霉发酵生产黑曲霉发酵生产 a-a-淀粉酶淀粉酶0909 生物技术（生物技术（2 2）班）班 曹运鹏曹运鹏 0912104709121047 摘要摘要：本实验按照一定的接种量向 5L 搅拌式发酵罐接种，并定时取样（每隔六小时取一次 样） ，测量了发酵期间不同时段所取样品的 PH、生物量、酶活、残糖等参数随时间的变化。 发酵三天后放罐（大约 66h） ，并分析了参数变化的原因，从而得到黑曲霉生产 a-淀粉酶各 种物质和理化性质的变化。 关键词关键词：黑曲霉 发酵 a-淀粉酶 生物量 pH 酶活 一、材料和方法一、材料和方法：1.11.1 材料材料 菌种：黑曲霉 PDA 培养基：土豆 200g（
2、去皮）煮沸 30min 过滤，加糖 20g，加水定容至 1L. 碘液：称取 0.5gI2 ,5.0gKI，研磨溶解于少量蒸馏水，定容至 100ml，褐色溶剂瓶内保 存，避免阳光直射。 稀碘液：原碘液稀释 100 倍，当天配制。 0.5%淀粉液：称取干燥过的可溶性淀粉 0.5g，加 5ml 缓冲液搅拌混合，再徐徐加入 70ml 煮沸的缓冲液，继续煮沸 2min，冷切至室温，定容至 100ml。需当天配制。 缓冲液：K2HPO4-KH2PO4 （pH 为 6.0） 发酵培养基（g/l）：淀粉 200g；柠檬酸氢二氨 100g；KH2PO4 15g;CaCl2 0.5g;七水 硫酸亚铁 0.05g；
3、七水硫酸镁 0.05g；水 5.0L，pH 调至 4.67；消泡剂 2.0mL。 蒽酮试剂：溶解 0.2g 蒽酮于浓硫酸 1L 中，当天配制使用。 1.21.2 方法方法 1.211.21 菌种制备菌种制备 先配制好 PDA 培养基，分装好，向各瓶中接入黑曲霉，170rpm 摇瓶，28c 培养。 1.221.22 设备设备 罐体结构：发酵罐上部有进料口、取样口、冷凝器和尾气过滤器，罐内有搅拌油、挡 板、消泡靶。 水通道：分为冷却水和夹套水。冷却水可以使培养基降温，在发酵过程中，可以和夹 套水一起控制发酵温度，夹套水为循环水，可以冷却也可以保温。 空气通道：空气经空压机压缩后，进入储气罐，经油水
4、分离进入玻璃转子流量计，经 过滤器后，进入罐底的空气分布器，尾气经罐顶过滤器后排出。 1 1.2323 空消空消 把发酵罐顶部管道全部夹住，用罩子罩住。打开蒸气发生器使夹套温度上升至 70-80， 然后打开发酵罐罐体阀门时蒸汽进入其中，当温度上升到 121压强在 0.1-0.15Mpa 之间， 稍微打开蒸汽出气口使体系温度和压强维持稳定，灭菌 20min，结束后关闭蒸气管路，打开 管道。 1.241.24 实消实消 把配好的 5L 培养基由进料口加入，加 2ml 消泡剂，打开蒸汽管道，121c 霉菌 30 min，灭菌结束后，打开冷凝水的通道，关闭蒸汽管道，打开空气管道。 1.251.25 接
5、种接种 待罐内温度降至 28c 时，在进样口附近用酒精棉球点火，接入上述培养好的菌种。 1.261.26 发酵发酵发酵过程中要注意罐内的温度、压强等参数是否正常，每隔 6h 取样一次二、实验步骤二、实验步骤2.12.1 残糖的测定残糖的测定1 本实验残糖的测定方法采取的是硫酸蒽酮法。设定的空白组是 1.0mL 的蒸馏水加入 4.0mL 的硫酸蒽酮溶液；实验组是 1mL 的稀释的残糖溶液加入 4.0mL 硫酸蒽酮溶液（三个平 行组，并在冰水浴进行） 。放置沸水中 10min，在置于冰水浴中 10min，在 620nm 处测吸光 光度值。 2.22.2 酶活的测定酶活的测定2 设立对照组，空白组和
6、实验组。 空白组：0.5ml 蒸馏水+5.0ml 稀碘液； 对照组：5.0ml0.5%淀粉40预热 10min加入 0.5mL 缓冲液 5min加入 5.0mL 稀硫酸终止反应 从反应体系中取出 0.5ml 的反应液加入 5.0mL 的稀碘液中 实验组：5.0ml0.5%淀粉40预热 10min加入 0.5mL 酶液 5min加入 5.0mL 稀硫酸终止反应 从反应体系中取出 0.5ml 的反应液加入 5.0mL 的稀碘液中 对上述所得的溶液进行可见光分光光度计法测量，记下数值并标明稀释倍数 D； 2.32.3 生物量的测定生物量的测定3 每隔六个小时物一次样，每次取样 10mL，对所取的样品
7、进行离心 5000rpm，5min；弃 上清（用来测定酶活和残糖含量） ，将得到的沉淀物刮至培养皿中放到 180的烘箱中 1h。 拿出来称量即为该批次的生物量（事先称好培养皿的重量） ； 2.42.4 pHpH 值得测定值得测定将每次取得的发酵液用 pH 计进行测量，记录每次数据。三、实验数据记录及数据处理，结果分析三、实验数据记录及数据处理，结果分析3.3. 1 1 生物量的变化生物量的变化 时间 （h）0612182430364248546066生物量 (g)0.0030.0260.0410.1560.0520.0640.0720.0820.1050.0410.090.102生物量变化0.
8、0030.0260.0410.1560.0520.0640.0720.0820.1050.0410.090.10200.050.10.150.2010203040506070 时间生物量系列1 系列2生物量随时间的变化趋势生物量随时间的变化趋势 生物量：生物量： 其变化是随着时间的推移而逐渐增加的，其中 18h 的数据可能由于取样时后实验操作的错 误导致很大的波动，应舍去。其中 42-60h 的波动可能由于取样时的误差，使得每次所取得 10ml 发酵液中生物量的变化不同3.2 发酵液发酵液 pH 值的变化值的变化 时间 （h）0612182430364248546066pH 值 5.135.1
9、45.015.084.984.884.824.574.634.674.494.2pH变化5.13 5.145.015.084.984.88 4.824.574.63 4.674.494.20123456010203040506070 时间pH值系列1pH 值随时间的变化趋势值随时间的变化趋势 pH 值值： pH 值大体上是呈下降趋势，但变动的幅度不大，这可能是接入的的黑曲霉量较少，以致 黑曲霉在发酵过程中所产生的 CO2及酸性物质对培养基的影响较小。0-12h 变化幅度不大， 基本上维持在 5.1 左右，此时是由于黑曲霉在发酵罐中的延迟效应，菌种代谢不旺盛，故 pH 的变化不大，随后随着菌种的
10、活化，菌种新陈代谢的旺盛，CO2 的释放以及糖浓度的降 低使得发酵液的 pH 值逐渐下降，发酵后期，菌种的活力下降，溶液的各理化性质趋于稳定 pH 保持在 4.5 左右；.在曲线中第八组数据出现波动稍大,这可能是在取样的烧杯没洗干净, 由于其壁上残留有酸性物质3.3 酶活的变化酶活的变化 时间 （h）0612182430364248546066酶活 03544567891040113013012881742197301106212050酶活变化03544567891040 1130130128817421973011062120500200040006000800010000120001400
11、0010203040506070 时间酶活系列1酶活随时间的变化趋势酶活随时间的变化趋势 a-a- 淀粉酶的活力：淀粉酶的活力： 总体上是呈上升趋势，在发酵初期，由于菌种的代谢慢，总量少，所以 0-30h 内酶活测 定数值比较小，此后 由于菌种达到对数期和稳定期黑曲霉的产酶能力加强，因此所得到的 数值也就越来越大；3.4 残糖的变化残糖的变化 时间 （h）0612182430364248546066生物量 (g)1.9561.781.4281.151.2150.8411.5951.5591.5221.5671.7091.714残糖变化1.9561.781.428 1.151.2150.8411
12、.5951.5591.5221.5671.7091.71400.511.522.5010203040506070 时间残糖值系列1残糖虽时间的变化趋势残糖虽时间的变化趋势 残糖：残糖： 变化理论上应该是越来越小，但是实验中残糖开始时值呈现越来越小，后来突然边大了，归结原因可能如下： 1.在后期发酵罐中出现较多的气泡，取样时可能由于气泡的影响导致糖的浓度不断呈现无 规律性变化； 2.测量时所用的硫酸蒽酮法各实验条件不是最适的，各物质的量不是最优的； 3.操作不规范，稀释倍数不合理。 4、可能每次数据由不同人测量，操作时出现误差。3.5 残糖的标准曲线残糖的标准曲线残糖标准曲线y = 141.22
13、x - 1.2819 R2 = 0.9989010203040506070809000.20.40.60.8残糖量 线性 (残糖量)残糖的标准曲线残糖的标准曲线四、结果讨论与思考四、结果讨论与思考1 酵罐实消之后由于里面压强过高导致发酵罐里的料液喷出，致使后来重做 2 验第一天晚上值班的时候水管突然爆裂开来，造成温度过高一段时间 3 自动控制系统不知道什么原因自动变成手动了 4 酵罐后面里面气泡过多 上面的这些原因虽然经过我们的不断修正但也是结果造成误差的最大原因另外中出现很多 处错误，原因也有很多。还有时操作不规范，灭菌操作不规范，还有每个数据都是由不同 人测量得到的，而每个人实验操作习惯等等都不相同，导致实验中的数据有很大的偏差。 经过这次实验让我们知道了，一件事情要想做好团队精神是很重要的，同时每件事情都要 认真对待，不能认为人多就抱着“打酱油”的心态，另外在遇到事情时我们要冷静对待， 找出最好的解决办法。参考文献.1邓长江.李长清.蒽酮-硫酸法测定出芽短梗霉发酵液残糖和总糖含量的研究.食品与药品.2006.8(11). 2江涌明.路广强等.蛋白酶水解淀粉芽孢杆菌 a-淀粉酶活力的影响.微生物学通报.1995.22（1）3杨培华.耐酸性 -淀粉酶发酵动力学的研究.实验报告与理论研究.2008.11（8）.
