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1、1巴戟天对被微波损伤性腺轴雄鼠的修复作用巴戟天对被微波损伤性腺轴雄鼠的修复作用一、实验试剂：一、实验试剂：放射免疫法试剂盒（测定 FSH、PRL)，2%戊巴比妥钠，4%多聚甲醛，苏木精-伊红(HE)染料，10中性福尔马林，3.5%重铬酸钾溶液，1.5%AgNO3 双蒸水溶液，二甲苯，二甲苯，30蔗糖蛋白甘油，0.1焦油紫，SP 染色法试剂盒，羊抗 GnRH（一抗） ，兔抗羊（二抗） ，10%羊血清，10%正常兔血清，巴戟天(产地广东)购自广州中医药大学大药房，甲睾酮片(上海信谊药业有限公司，批号：020801)，规格 5mg片。二、实验仪器：二、实验仪器：微波发生仪及监测仪、眼科小剪子、Oly
2、mpus2DP12 摄像显微镜、精子分析系统、冷冻切片机、JA1203 电子天平三、实验步骤：三、实验步骤：（一）实验模型的建立：（一）实验模型的建立：选取成熟雄性大鼠 30 只，随机平均分为 3组，其中 1 组为空白组，1 组为辐射组，1 组为给药组。每组 10 只放入塑料盒中，动物自由体位，在相对湿度为 45%，温度为 18环境下进行饲养。空白组：空白组：不采用辐射。辐射组：辐射组：采用 900MHz 辐照，平均功率密度为 10mW/cm2，照射时间均为 2h/d,持续一周。给药组：给药组：采用 900MHz 辐照，平均功率密度为 10mW/cm2，照射时间均为 2h/d，持续一周。微波辐
3、射完后,就开始在卯时（5：007：00）巴戟天灌胃给药，30g/kg，1 次/d, 持续一周。2注：煎煮巴戟天：取注：煎煮巴戟天：取 900g900g 巴戟天用巴戟天用 7 7 倍水浸泡倍水浸泡 1 15h5h，煎煮，煎煮30min30min，药渣用，药渣用 4 4 倍水煎煮倍水煎煮 20min20min，最后，最后 2 2 者混合浓缩成者混合浓缩成 300ml300ml（二）性行为测定（二）性行为测定:1）实验前配备 15 只同种性成熟未交配雌鼠，雌鼠于实验前 2d 每天皮下注射 2mg/kg 复方苯甲酸雌二醇，促进其进入动情期。进行性行为实验时，挑取一只雄鼠放于观察笼中，适应环境 3min
4、，再放入一只处于动情期的雌鼠，测定雄鼠爬跨潜伏期、射精潜伏期、爬跨次数、射精次数、射精持续时间和射精间隔期等指标，每只雄鼠观察25min，观察时保持相对黑暗环境，于下午与晚上进行。观察时同时用摄观察时同时用摄像头记录。像头记录。测试开始时，用以下标准和指标定量评价性行为:爬跨:雄鼠骑跨并用前爪抵住雌鼠双肋，其骨盆自发性迅速地猛烈撞击雌鼠;射精:随着性交过程中骨盆撞击速度增加，雄鼠出现剧烈的颤动及阴茎的深插，完成射精过程。在此过程中，雄鼠用四肢紧抱雌鼠，阴道涂阴道涂片可找到精子片可找到精子; ;爬跨潜伏期爬跨潜伏期: :从合笼到第一次爬跨行为的时间;射精潜伏期射精潜伏期: :从合笼到射精开始之间
5、的时间;射精持续时间:在射精期间，雄鼠抱紧雌鼠的时间;射精间隔期射精间隔期: :从有射精的爬跨结束到下一次具有射精的爬跨开始之间的时间；扑捉潜伏期扑捉潜伏期: :(captureincubationperiod，CIP)自雌鼠投入至雄鼠第一次扑捉雌鼠的时间。2）统计学方法： SAS6112 软件进行分析，结果以(xs)表示，同时3进行组间 t 检验比较，并进行回归分析。（三）激素水平检测（三）激素水平检测: :取大鼠外周血液，4000r/min，离心 10min，放射免疫法测定血清样本中催乳素(PRL)、卵泡刺激素（FSH）水平，按试剂盒说明书操作。（四）对大鼠睾丸、附睾的相关检测：（四）对大
6、鼠睾丸、附睾的相关检测：将大鼠腹腔注射 2%戊巴比妥钠(6ml/100g)麻醉后，取出睾丸和附睾组织。然后将睾丸逐一称重。(1)标本制备：标本制备：将其中一侧的睾丸组织灌流固定？（取出后用固定液固定） ，然后沿着与其长轴垂直的方向切为头段及尾段？（沿其长轴矢状切面切为头段和尾段） 。睾丸组织在4%多聚甲醛中后固定过夜。常规脱水、透明、包埋，切片35m，苏木精-伊红(HE)染色。(2)精子悬液制备精子悬液制备:取另外一侧附睾，置于2ml生理盐水(37预温)的小平皿中，用眼科小剪子剪碎，吸管吹打，四层擦镜纸过滤。(3)组织形态学分析：组织形态学分析：从每个实验大鼠的头段及尾段睾丸组织切片中随机选取
7、5张切片，每张切片中随机挑选10个视野，然后测量各视野中生精小管的管腔直径(tubulardiameter，TD)和上皮高度(seminiferousepitheliumheight，SEH)，并统计生精细胞的发育状况。组织切片的图像通过Olympus2DP12摄像显微镜(日本)拍摄获得，图像的具体测量及统计方法如下:TD及SEH的数值由沿着生精小管短轴的方向测量获得;生精小管中生精细胞发育状况由每个生精小管中处于最晚发育阶段的生精细胞类别决定，并统计处于不同发育阶段的生精小管所占的比率。生精细胞被分为以下几个发育阶段:精原细胞，细线前期至偶线期初级精母细胞，粗线期初级精母细胞至次级精母细胞，
8、精子细胞(期)，精子细胞(期)，4精子细胞(期)。(4)精子参数测定:用计算机辅助精子分析系统？（精子悬液置于37 孵育15 分钟, 用红细胞计数板, 在高倍镜下计数200 个精子中活动精子数。于60 水浴中处死精子, 按红细胞计数法, 计数5 个中方格内精子数, 计为R然后按公式R 50000 5/ 附睾尾重, 获得每克附睾尾中精子数）观察精子密度、活动率。睾丸病理组织学观察:大鼠右侧睾丸置于Bouin液中固定，石蜡切片，HE染色，光镜下观察。 （5）生精小管：用SPSS13.0软件进行双因素方差分析及q检验，P0.05为差异有显著性。（6）精子:所有数据采用均数标准差(xs)表示，方差齐用
9、t检验，方差不齐采用t检验，显著性水准均为P0.05。（五）核团神经元的染色（五）核团神经元的染色（视上核、视旁核、弓状核、腹正中核、视交叉上核、下丘脑前区和视前区。 ）：10中性福尔马林心内灌流固定。灌毕即取脑，将下丘脑分为两块（一块用于神经元染色，一块用于 SP 法染色） ，厚 35mm。1 1、GolgiGolgi 染色：染色：1 1）铬化：）铬化：修块 3mm 厚，放入 3.5%重铬酸钾溶液，每日定时换液，连续 1 周。2 2）浸银：）浸银：用 1.5%AgNO3 双蒸水溶液洗净组织块，并放入1.5%AgNO3 双蒸水溶液中浸银 5d，每日换液 1 次，常温避光保存。3 3）脱）脱水：
10、水：梯度酒精脱水，70%酒精 24h，80%酒精 8h，95%酒精6h，95%酒精5h，无水酒精、无水酒精、无水酒精各 2h。4 4）透明：）透明：二甲苯、二甲苯各 15min。2 2、用、用 NisslNissl 法复染法复染 GolgiGolgi 法镀染的切片：法镀染的切片：1)1)浸培：浸培：将镀染后的脑块置 30蔗糖 l2-24h(置 4“C 冰箱内)。2 2）切）切5片：片：连续冠状冰冻切片，片厚 50um。蛋白甘油涂载玻片，贴片。3 3）脱脂）脱脂下行入水：下行入水：切片依次置于二甲苯，100、95、70酒精及双蒸水。每步 l0min，二甲苯 3 次，每次 10min。4 4）Ni
11、sslNissl 复染：复染：01焦油紫复染20min。5 5）脱水，透明：）脱水，透明：复染后的切片再经 70、95、100酒精脱水，二甲苯透明。每步 10min，其中 100酒精和二甲苯各 3 次，每次l0min。6 6）封片：）封片：中性树脂加盖玻片封片。光镜下观察复染的结果。3 3、脑核团定位：、脑核团定位：参考大鼠脑图谱4.4.切片的制备切片的制备: :取另一块下丘脑脑块，常规石蜡包埋，连续切片，厚5um，56烘箱烤 24h，备用。5.SP5.SP 法染色：法染色：（福建迈新公司提供试剂盒） （促性腺激素释放激素GnRH 的测定）：依次脱腊，3%H2O2 孵育 10min，0.1M 枸橼酸缓冲液加热5min 以修复抗原，PBS 液漂洗，10%羊血清孵育 25min，一抗 4过夜，PBS 液冲洗，生物素标记的二抗 37孵育 30min，PBS 液冲洗，链霉菌素标记的卵白素 37孵育 30min，PBS 液冲洗，DAB 液显色，复染，脱水，透明，封片。相邻切片染色所用一抗分别为 GnRH（稀释度 11500） ，10%正常兔血清，另外一套切片进行苏木精-伊红染色。
