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1、四环素生产菌诱变育种与四环素生产菌诱变育种与 发酵性能的研究发酵性能的研究中国抗生素杂志 2000 年第 2 期第 25 卷 论著作者：王敏 路福平 王建玲 杜连祥单位：天津轻工业学院食品工程系， 天津 300222关键词：四环素；诱变育种；金色链霉菌摘 要 采用紫外线对四环素生产菌金色链霉菌 4-28 的原生质体进行诱变处理，选育得到一株高产突变株 H32-37。该菌在形态上与出发菌株存在明显差异：菌落小，呈圆形或梅花形，表面粗糙，孢子丰富，孢子颜色深，四环素生产能力比出发菌株提高 23.9%。研究了其发酵性能，优化了培养基组成和发酵工艺条件，使四环素效价提高了 44.4%。Study on
2、 the breeding of high tetracycline producing strainsand their fermentation characteristicsWang Min， Lu Fuping， Wang Jianling and Du Lianxiang(Department of Food Engineering, Tianjin Institute of Light Industry， Tianjin 300222)ABSTRACT Protoplast of the Streptomyces aureofaciens 4-28 strain was mutat
3、ed by UV, a high-yielding strain H32-37 was obtained. The apparent differences in morphology between the strain H32-37 and the parent strain were as follows: the colony is smaller,round-shape or plum blossom-shape, rough surface,spores output plentiful, deep gray. Its tetracycline production is 23.9
4、% higher than that of the parent. The fermentation characteristics were investigated, the medium and fermentation condition were optimized. Under the optimum condition,the tetracycline activity increased by 44.4% in comparison with that of the parent one.KEY WORDS Tetracycline； Mutation breeding； St
5、reptomyces aureofaciens四环素具有抗菌谱宽、急性毒性较低、副作用较小的优点，此外通过化学改造可制备有临床价值且疗效更为优越的半合成四环素，保证了它在抗感染药物领域中的重要地位。近年来，四环素在非感染性疾病中的临床应用也得以不断发展。例如它对癌性胸腔积液、肝性胸水、恶性心包积液等疾病均有良好的治疗效果1，2 。金色链霉菌自 20 世纪 50 年代就开始做为四环素的生产用菌，为提高产量，以前多采用对其孢子进行诱变的方法。近年有不少运用原生质体形成和再生来提高抗生素产量的成功报道3，4 。本文利用紫外线对金色链霉菌的原生质体进行诱变处理，选育得到优于原生产菌株的高产菌株 H32
6、-37，并对其发酵特性及发酵工艺进行了研究。1 材料与方法1.1 出发菌株金色链霉菌(Streptomyces aureofaciens)4-28，本院应用微生物研究室提供。1.2 培养基(1)斜面培养基(%)：麸皮 3.6，琼脂 2.4，pH 自然。(2)平板分离培养基(%)：面粉 2，蛋白胨 0.1，KH2PO4 0.05，琼脂 2，pH 自然。(3)种子培养基(%)：黄豆饼粉 2，淀粉 4，蛋白胨 0.5，酵母粉 0.5%，CaCO3 0.4，(NH4)2SO4 0.3，NaBr 0.2，MgSO4 0.025，KH2PO4 0.02，pH 自然。(4)发酵培养基(%)：黄豆饼粉 4，淀
7、粉 10，酵母粉 0.25，蛋白胨 1.5，(NH4)2SO4 0.3，CaCO3 0.5，NaBr 0.2，MgSO4 0.025，2-巯基苯丙噻唑 0.0025，pH 自然。(5)再生培养基5 。(6)S 培养基5 。(7)P 稳定液5 。1.3 培养条件将菌种接于斜面培养基，35培养 45d，孢子成熟后，配制成浓度为 107 个/ml 的孢子悬浮液。取 1ml 接种于种子培养基，31振荡(180r/min)培养 1618h。按 8%接种量将种子培养液接入发酵培养基中，于 31振荡(260r/min)培养 6d。取样，测定四环素效价。1.4 原生质体的制备取 1ml 孢子悬浮液接种于 S
8、培养基中，28振荡(180r/min)培养 9h，按 2%接种量转接于含有 1%甘氨酸的新鲜 S 培养基中，继续培养 17h。离心收集菌体，用 P 液洗涤两次，然后悬浮于溶菌酶液(2mg/ml)中，32处理 90min。过滤除去酶液，用 P液洗涤两次，最后用 P 液配制成 107 个/ml 的原生质体溶液。1.5 原生质体的紫外线诱变取 10ml 原生质体溶液(浓度 1.0107 个/ml)于培养皿中，在紫外灯(15W，照射距离 30cm)下照射一定时间进行诱变处理。1.6 突变株的挑选经紫外线处理后的原生质体细胞适当稀释，倾注于再生培养基上。待长出菌落后，采用影印法转接于平板分离培养基上，3
9、5培养 35d。然后依据其菌落形态挑选所需菌株，接于斜面试管。1.7 四环素效价的测定用比色法测定6 。2 结果2.1 突变株的筛选金色链霉菌的原生质体经紫外线诱变处理后得到大量突变株。这些菌株在形态上差异较大，依据其菌落形态、菌落大小、孢子颜色和孢子丰满程度等特征划分为 6 类，列入表 1。将每类菌株各挑选若干株进行摇瓶初筛，对实验数据进行分析统计，结果见表 1。从表 1 的实验结果可以看出，突变株的菌落形态与四环素发酵效价之间存在有一定的对应关系，H1 和 H2 类菌株与原菌的效价相差不大；不产孢子的 H5 类菌株效价最低；而 H3 类菌株效价普遍偏高。即菌落呈圆形或梅花形、表面粗糙、孢子
10、鼠灰色或深灰色、孢子量大、丰满且菌落较小的突变株，往往是发酵效价得以提高的表现。从这类菌落中挑选效价较高的菌株H32 做为下一轮诱变的出发菌株，经同样方法进行原生质体紫外线处理，以 H3 类菌株的形态特征做为初筛指标，以摇瓶发酵进行复筛。从中得到 1 株发酵效价进一步提高的菌株 H32-37，其四环素发酵效价可达 22500r/ml，比原菌 4-28 提高了23.9%。采用沙土管保藏并进行传代实验，证明其遗传性能稳定。高产菌株 H32-37 的选育谱如下：2.2 发酵性能试验表 1 突变株的形态特征和发酵效价分类菌落形态 菌落表面菌落直径(mm)孢子颜色孢子丰满程度四环素相对效价(%)对照表面
11、平坦，有的产生同心园光滑 3.54.5 鼠灰色 较丰富 100H1 草帽形，表面平坦，有的产生同心园光滑 3.04.0 鼠灰色 丰富 97.1103.2H2 草帽形，表面有裂纹，有的中央凹陷，较粗糙 3.04.0 鼠灰色 丰富 100.4107.5 有的呈辐射条纹状 H3 圆形或梅花形，有的中央凹陷，有的粗糙 2.00.5 鼠灰色或非常丰富107.4125.8 呈辐射条纹状 深灰色 H4 草帽形，表面平坦光滑 3.04.0 灰色 较丰富 88.095.4H5 白色，光秃光滑 1.52.0- - 03.0H6 表面平坦，有白色或黄色角变光滑 4.05.0 浅灰色 一般 30.651.7 2.2.
12、1 菌株 H32-37 对通气量的敏感性 在摇床转速一定的情况下，以不同的发酵摇瓶装液量考察菌株对通气的需求，结果见图 1。由图 1 可知菌株 H32-37 在摇瓶装液体积增加 20%时效价减少5.6%左右，而原菌减少了 11.8%；当装液量增加 80%，通气效果很差的情况下，菌株 H32-37 的效价仍有 58%，而原菌的发酵已出现异常现象，效价仅为 10%左右。因此，通气量的波动对新菌株产生的影响较小。2.2.2 菌株 H32-37 对无机磷的敏感性 菌株 H32-37 与原菌 4-28 的发酵摇瓶以不加无机磷为对照，其它各组分别添加不同浓度的 KH2PO4 与对照组对比，观察对无机磷的敏
13、感性，结果见图 2。图 2 表明加入 0.01%的无机磷，菌株 H32-37 的效价在96.4%，当无机磷量由 0.03%增加到 0.1%时，效价的下降趋于平缓；而原菌 4-28 在加入 0.03%的无机磷，效价的下降幅度已经加大，无机磷量继续增加，效价下降也趋于平缓，但始终低于H32-37 菌株。2.3 发酵工艺试验2.3.1 发酵培养基的优化 为确定菌株 H32-37 的最佳发酵培养基，对培养基中碳源(淀粉)和主要氮源(黄豆饼粉、硫酸铵)及碳酸钙四组分的配比，采用四因素三水平 L9(34)的正交实验进行优化。通过对发酵结果的 R 值分析表明，影响四环素发酵效价的显著因素为硫酸铵，碳酸钙和黄
14、豆饼粉也有一定影响，而淀粉几乎没有影响。从中得到的最佳发酵培养基配方为：淀粉 10%，黄豆饼粉 3%，硫酸铵 0.3%，碳酸钙 0.7%；在此培养基内，发酵效价可达 24300r/ml，比原配方提高 5.6%。图 1 摇瓶装液量对四环素效价的影响1：菌株 H32-37； 2：菌株 4-28图 2 无机磷添加量对四环素效价的影响1：菌株 H32-37； 2：菌株 4-282.3.2 种龄的影响 分别以培养 15、17、19、21、23h 的种子接种于发酵培养基中，31发酵 6d。结果 17h 种龄的种子接入发酵培养基后发酵效价最高，为 25600r/ml；而种龄大于17h 的随着种龄的延长，种子
15、液的 pH 逐渐下降，转入发酵后最终的四环素效价也随之降低。17h 的种子液，接出时的生理特征主要有：pH 值为 6.66.3，外观稍粘稠、色泽微黄、镜检观察菌丝粗壮且形态呈菊花状菌丝团。2.3.3 接种量的影响 在 4%12%范围内试验接种量对四环素效价的影响。结果表明接种量对发酵的终效价影响不大，以 6%8%为宜。2.3.4 摇瓶发酵时间曲线 在 250ml 摇瓶中， 在已确定的最佳发酵条件下，菌株 H32-37 的发酵时间曲线如图 3。图 3 菌株 H32-37 的发酵过程曲线1：总糖； 2：四环素效价； 3：氨基氮； 4：pH3 讨论金色链霉菌经溶菌酶处理形成的原生质体细胞，可增大对紫
16、外线的敏感性。选育出的菌株 H32-37 是一株形态上变异较大的高产菌株，四环素生产效价可稳定在 26000r/ml，较出发菌株提高了 44.4%。其发酵性能较好且遗传性稳定，具有一定的生产应用前景。王敏，女，生于 1971 年，在读博士生。参考文献1，丁焕新. 四环素在非感染疾病中的临床应用. 新医学，1989；20(3)：1522，刘加升. 四环素在外科疾病中的硬化治疗近况. 新药与临床，1991；10(5)：2853，Ford L M, Eaton T E, Godfrey O W. Selection of Streptomyces ambofaciens mutants that produce large quantities of spiramycin and determination of optimal conditions for spira-mycin production. Appl Environ Microbiol，1990；56(11)：35114，Ro
