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1、几种消毒剂对蚋卵原几种消毒剂对蚋卵原 代细胞培养效果的比代细胞培养效果的比 较较【摘要】目的： 探索适宜于蚋卵(胚胎)原代细胞培养的消毒方法。方法： 70%乙醇、2.8%NaClO、15%甲酚皂、0.1%HgCl2 及 1%过氧乙酸 5 种消毒剂按不同消毒时间相互搭配，结合使用抗生素PBS 液对蚋卵进行消毒处理。结果： 70%乙醇 10 min、1%过氧乙酸 15 min、2.8% NaClO 5 min 3 种消毒剂的相互搭配，结合使用了抗生素 PBS 液，使得原代细胞培养污染得到有效控制，细胞生长和增殖状态较好。结论： 70%乙醇 10 min、1%过氧乙酸 15 min、2.8% NaC
2、lO 5 min 联合使用是蚋卵原代细胞培养的一种安全有效的消毒方法。 【关键词】 蚋科; 消毒药(剂); 细胞培养; 消毒效果 Comparison of Sterilizing Effects of Several Disinfectants onBlackfly Eggs in Primary Cell CultureZHOU Jing1, CHEN Hanbin2, YANG Ming2(1. Department of Medical Biotechnology, Guiyang Medical College, Guiyang 550004, Guizhou, China;2. D
3、epartment of Biology, Guiyang Medical College, Guiyang 550004, Guizhou, China)Abstract Objective: To explore disinfecting methods for primary cell culture of blackfly eggs (embryos). Methods: Different combination of 70% ethanol, 2.8% NaClO, 15% cresol soap, 0.1%HgCl2 or 1% peroxyacetic acid respect
4、ively with antibiotics PBS, and combination of their different montages were tried to disinfect eggs (embryos) for different minutes, and the results were compared. Results: Combination of 70% ethanol treating for 10 min, 1% peroxyacetic acid for 15 min, and 2.8% NaClO for 5 min plus treatment of an
5、tibiotics PBS controlled contamination effectively and cells of the first generation grew well in vitro. Conclusions: The joint use of 70% ethanol for 10 min, 1% peroxyacetic acid for 15 min, and 2.8% NaClO for 5 min is a safe and effective scheme for blackfly eggs (embryos) disinfection in primary
6、cell culture.Key words simuliidae; disinfectants; cell culture; disinfection effect蚋类，俗称黑蝇(blackflies)，隶属于昆虫纲(Insecta)，双翅目(Diptera)，蚋科(Simuliidae)，是人类和禽畜多种疾病的传播媒介，其中包括人盘尾丝虫病(Onchocerciasis)、畜类盘尾丝虫病和由欧氏曼森线虫(Mansonella ozzardi Manson，1891)引起的曼森丝虫病及禽鸟住白细胞虫病(Leucocytozoonsis)等疾病，引起学者的广泛关注，并在基础分类、生态学、疾病关
7、系和防制等领域的研究取得长足的进展1。本课题于 2009 年3 月2010 年 4 月开展了蚋类原代细胞培养的探索研究。由于其组织细胞来源于野外采集蚋卵(胚胎)，存在生境污染的复杂性，如何选取适合的消毒剂及消毒时间配伍对蚋卵进行有效灭菌处理是蚋类原代细胞培养及细胞系建立的瓶颈问题。本实验选取几种不同消毒剂相互配伍，分别考察其对细胞培养的影响，以确定原代培养阶段适宜的消毒方法。1 材料与方法1.1 试剂和仪器Schneider and Sang M3 培养基、抗生素混合液及胰岛素均购自 Sigma 公司，胎牛血清(FBS)为 Hyclone 公司产品。次氯酸钠、甲酚皂、氯化钙、过氧乙酸购自重庆茂
8、业化工厂，无水乙醇购自上海振兴化工一厂。青霉素、链霉素购自华北制药厂。体视显微镜为 OLYMPUS 公司产品，倒置显微镜为江南公司产品，细胞培养箱购自美国 SHELLAB 公司，超净工作台购自苏州净化设备有限公司。1.2 方法1.2.1 培养基及抗生素 PBS 液配制 改良型 Schneider and Sang M3 培养基：Schneider and Sang M3 添加胰岛素 5 mg/L、20%灭活 FBS、5%抗生素混合液。抗生素 PBS 液：PBS 液添加青霉素、链霉素各为 4 000 U/ml。1.2.2 标本采集与处理 蚋卵前幼虫期胚胎，采自贵阳市郊区溪流中不同基质上，投入蚋类
9、饲养系统中进行预处理，待胚胎发育到前幼虫期(红眼点可见，破卵器形成)可用于原代细胞培养2。蚋卵前幼虫期胚胎，去氯水充分冲洗，以去除卵筏上杂物。体视显微镜下逐个剥离，作原代细胞培养用。1.2.3 几种消毒剂配伍 本研究主要选择了 2 种高效消毒剂(1%过氧乙酸，2.8%NaClO)、2 种中效消毒剂(70%乙醇，15%甲酚皂)和1 种低效消毒剂(0.1%HgCl2)联合使用，根据不同的消毒剂和不同的消毒时间相互搭配，共有 6 种处理方案，重复 3 次37。见表 1。表 1 不同消毒剂和消毒时间的相互搭配(min)1.2.4 原代细胞培养 将蚋卵在无菌条件下，分别按表 1 中 6 种消毒方案进行蚋
10、卵的卵壳消毒，PBS 彻底冲洗，以去除残留消毒液。抗生素 PBS 液浸泡 30 min，PBS 冲洗 3 次。眼科剪将胚胎组织剪碎为 1 mm3 组织块。加入 1/2 体积 0.25%的胰蛋白酶，27 处理 10 min,纱布过滤,滤液 800 r/min,离心 5 min。清洗 12 次，细胞培养基悬浮组织块和细胞，接种于经 PLL 包被的 35 mm2 一次性塑料培养皿中,27 培养箱中静置培养8。1.2.5 原代细胞培养观察 定期观察培养基清洁度、污染情况及组织细胞的生长情况，根据细胞生长情况对原代培养细胞进行1/2、1/3 及 1/4 换液，记录原代细胞迁移、增殖生长情况，拍照留档。1
11、.3 消毒效果评判方法对于蚋卵的灭菌效果可从以下两个方面判定：一方面是培养基清澈度以及有无细菌、真菌等污染;另一方面是经一段时间培养后，组织块周围是否能形成拉网状细胞生长及组织块有无黑化现象，细胞形态是否规则、折光性是否好、有无细胞的增殖。为便于对多种消毒方案的评判，本实验从以上两方面，根据以下几种不同程度消毒效果进行综合评判。培养基情况分为：+：培养基清澈，镜下仅少量细菌或无细菌，无真菌等生长;+：培养基混浊，镜下可见多种细菌生长，无真菌等生长;+：培养基混浊，镜下可见多种细菌及真菌等生长。组织块及细胞生长情况分为：A+：培养组织块周围 34 d 可形成拉网状细胞生长，组织块无黑化现象，细胞
12、形态规则,折光性佳,23 d 多数细胞增殖生长;A+：培养组织块周围 1 周左右形成拉网状细胞生长，组织块无黑化现象，细胞形态规则，折光性可，45 d 部分细胞增殖生长;A+：培养组织块周围 1周以后有少量拉网状细胞生长，组织块有黑化现象，细胞形态不规则，折光性差，少量细胞增殖生长。2 结果2.1 原代细胞培养灭菌效果消毒方案一、二、三、四、五、六的消毒效果为：+A+、+A+、+A+、+A+、+A+、+A+。综合分析，方案一：70%乙醇 10 min、1%过氧乙酸 15 min、5.6%NaClO5 min 3 种消毒剂的相互搭配组合，并联合使用抗生素 PBS 液。此方案有效降低了微生物污染，
13、蚋卵胚胎组织和细胞在原代培养过程中能较好的生长、增殖。2.2 原代细胞生长经方案一的消毒方法，组织细胞接种 24 h 既可见组织块周围细胞迁移生长。培养 4 d 后组织块周围可见圆形细胞脱落生长(图 1)。培养 20 d 细胞增殖、生长，可观察到有丝分裂 2 个子代细胞(图 2、图 3)。25 d 圆形细胞成片生长占培养基底部1/5(图 4)。证实了原代细胞培养消毒方法适宜，细胞生长状态良好。 图 1 原代细胞培养第 4 天 图 2 原代细胞培养第 20 天3 讨论实验标本蚋卵采自野外，污染源较为复杂，单一的消毒剂难以达到理想的灭菌效果，应将高效消毒剂、中效消毒剂及低效消毒剂三种消毒剂联合使用
14、。本研究选用了高效消毒剂：过氧乙酸、次氯酸钠;中效消毒剂：乙醇、甲酚皂;低效消毒剂：氯化汞。Schneider 等将次氯酸钠、乙醇及氯化汞联合使用对室内获取的果蝇胚胎消毒处理取得较好效果9。次氯酸钠、乙醇也是国内外学者应用较多的昆虫表面消毒剂，但由于本课题选用蚋卵标本为野外采集，污染源相对复杂，因而应选用可杀灭细菌繁殖体、芽胞、真菌、病毒等病原体的广谱、低毒的消毒剂。经实验证明氯化汞及甲酚皂具有一定的灭菌能力，但对于污染复杂的标本需加大使用浓度及作用时间，而两者均具有较强毒性，对于细胞远期培养效果不理想。本实验初步选择了过氧乙酸、次氯酸钠、乙醇相互搭配，联合使用添加了抗生素的 PBS液浸泡消毒
15、，使得原代培养污染明显降低，细胞迁移、增殖生长状态也较好。过氧乙酸为一种高效消毒剂，对细菌繁殖体、真菌、芽孢和病毒都具高效的杀灭作用10。过氧乙酸主要是通过氧化作用和酸性作用致微生物死亡的：(1)通过氧化作用破坏细胞壁和细胞膜，进而破坏酶系统;(2)酸性作用直接损伤细菌。过氧乙酸的强酸性可改变细胞内 pH 值，破坏细菌的正常代谢作用。过氧乙酸对芽孢通透性屏障有较强的穿透力。有大量的文献报道，过氧乙酸在较低浓度和较短时间内能有效杀灭细菌繁殖体。过氧乙酸最终的生成物质为 CO2 和H2O，无有害物质残留，但其稳定性较差，高温易分解，因而需低温储存。【参考文献】1陈汉彬.中国吸血蚋类研究回眸J.中国
16、寄生虫学与寄生虫病杂志,2003(2):69-70.2Crosskey R W.Natural History of blackfliesM.New York:Wiley,1990:123-124.3宗东升,陈玉爽.过氧乙酸的特性及其使用方法J.辽宁药物与临床,2004(1):36-37.4Imogene Schneider. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogasterJ.Embryol exp Morph,1972(2):353-365.5颜林,潘李珍,张漪,等.三带咏库蚊细胞系的建立及其特征研究J.首都医学院学报,1989(4):289-293.6洪鹰,曾庆韬.嗜凤梨果蝇(Drosophila ananassae)细胞系的建立及其生物学特性初步观察J.2003(2):145-147.7贺莉芳,万启惠,徐大纲,等.影响家蝇胚胎细胞系建立
